實驗目的：分離蛋白質混合物，將樣品進行電泳后，為了不同目的在它的直角方向再進行一次電泳。常說的雙向電泳是根據蛋白質所帶的電荷和分子大小對蛋白質混合物進行分離。

實驗原理：*向等電聚焦的基本原理是利用蛋白質分子或其他兩性分子的等電點不同，在一個穩定的、連續的、線性的pH梯度中進行蛋白質的分離和分析。第二向運用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳根據分子量大小對蛋白質進行分離。

基本過程：等電聚焦、平衡及轉移到二向、SDS-PAGE

試劑或儲液：IPG buffer、礦物油、DTT、碘代乙酰胺、過硫酸銨、TEMED、1M DTT、rehydration buffer、平衡液儲液、30%丙烯酰胺單體儲液、1.5M Tris-HCl、10% SDS、10X Tris-甘氨酸系統的電泳緩沖液、0.5%瓊脂糖、水飽和正丁醇、占位液

實驗操作程序：

等點聚焦部分

1．根據選用的膠條的長度計算上樣體積（見附1），加1M DTT到終濃度50mM需要的體積，補加IPG buffer到終濃度0.2%或者0.5%的體積，加rehydration buffer到該膠條的上樣體積。

2．把各種溶液按計算的體積加入到eppendorf管中，充分混勻，（或者超聲5-10min）14000rpm,10℃離心5min。

3．取出膠條室溫放置10min，平衡膠條的溫度。

4．沿著聚焦盤中槽的邊緣從左至右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產生氣泡，否則影響到膠條中蛋白質的分布。

5．當所有的蛋白質樣品都已經加入到聚焦盤中后，用鑷子輕輕的去除預制IPG膠條上的保護層。

6．分清膠條的正負極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標有+，安瑪西亞膠條為）對應于聚焦盤的正極（安瑪西亞為）。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因為這些溶液不會被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產生氣泡。如果已經產生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。

7．在每根膠條上覆蓋1-3ml礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發析出尿素。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。

8．對好正、負極，蓋上蓋子。設置等電聚焦程序（見附2）。

9．聚焦結束的膠條立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條吸干礦物油置于平衡管中，-80℃冰箱保存。

注意事項：

參見“雙向電泳培訓班講義（定稿）”中等電聚焦注意事項部分。

附1：

膠條長度、上樣量、上樣體積、等點聚焦的伏小時數的設置及說明

膠條長度

7cm

11cm

13cm

17cm

18cm

24cm

上樣體積

125ul

185ul

250ul

300ul

350ul

450ul

銀染上樣量范圍 pH3-10L(ug)

5-100

15-200

25-250

30-300

40-400

50-500

推薦使用量（ug）

50

100

125

150

200

250

銀染VHrs

12000

20000

24000

30000

36000

52000

考染上樣量范圍 pH3-10L(mg)

0.05-0.5

0.15-1.2

0.25-1.5

0.25-2.5

0.75-3

1-4

推薦使用量（ug）

250

500

650

750

1000

1250

考染VHrs

22000

30000

34000

40000

46000

62000

說明：
1．pH3-10NL, pH4-7, pH6-11的上樣量與pH 3-10相比增加1.5-2倍，聚焦伏小時數延長約10000VHr
2．按照推薦量上預實驗，根據預實驗結果調整上樣量，樣品中蛋白質分布均勻按推薦量使用，如果有高豐度的蛋白質適當降低上樣量，如果顯得少則適當加大上樣量。聚焦的伏小時數可以根據聚焦的情況進行調整。