定位克隆（positoinal cloning），又稱圖位克隆（map-based clonig），1986年首先由劍橋大學的Alan Coulson提出。用該方法分離基因是根據功能基因在基因組中都有相對較穩定的基因座，在利用分離群體的遺傳連鎖分析或染色體異常將基因佇到染色體的1個具體位置的基礎上，通過構建高密度的分子連鎖圖，找到與目的基因緊密連鎖的分子標記，不斷縮小候選區域進而克隆該基因，并單明其功能和疾病的生化機制。
　　定位克隆技術主要包括以下6個步驟：
　　1.篩選與目標基因連鎖的分子標記。利用目標基因的近等基因系或分離群體分組分析法（BSA）進行連鎖分析，篩選出目標基因所在局部區域的分子標記。
　　2.構建并篩選含有大插入片段的基因組文庫。常用的載體有柯斯質粒（cosmid），酵母人工染色體（YAC）以及P1，BAC，PAC等幾種以細菌為寄主的載體系統。用與目標基因連鎖的分子標記為探針篩選基因組文庫，得到陽性克隆。
　　3.構建目的基因區域跨疊克隆群（contig）。以陽性克隆的末端作為探針基因組文庫，并進行染色體步行，直到獲得具有目標基因兩側分子標記的大片段跨疊群。
　　4.目的基因區域的精細作圖。通過整合已有的遺傳圖譜和尋找新的分子標記，提高目的基因區域遺傳圖譜和物理圖譜的密譜的密度。
　　5.目的基因的精細定位和染色體登陸。利用側翼分子標記分析和混合樣品作圖定位目的基因。接著以目標基因兩側的分子標記為探針通過染色體登陸獲得含目標基因的陽性克隆。
　　6.外顯子的分離、鑒定。陽性克隆中可能含有多個候選基因。用篩選cDNA文庫，外是子捕捉和cDNA直選法等技術找到這些候選基因，再進行共分離，時空表達特點，同源性比較等分析確定目標基因。當然，zui直接的證明是進行功能互補實驗。