堿裂解法提取質粒利用的是共價閉合環狀質粒DNA與線狀的染色體DNA片段在拓撲學上的差異來分離它們。在pH值介于12.0-12.5這個狹窄的范圍內，線狀的DNA雙螺旋結構解開變性，在這樣的條件下，共價閉環質粒DNA的氫鍵雖然斷裂，但兩條互補鏈彼此依然相互盤繞而緊密地結合在一起。當加入pH4.8的醋酸鉀高鹽緩沖液使pH降低后，共價閉合環狀的質粒DNA的兩條互補鏈迅速而準確地復性，而線狀的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已*分開，不能迅速而準確地復性，它們纏繞形成網狀結構。通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來，而質粒DNA卻留在上清液中。

(一)儀器
1．恒溫培養箱
2．恒溫搖床
3．小型高速離心機
4．高壓滅菌鍋
(二)材料
1．帶有pQE-31質粒和pUC18-CAT質粒的兩株大腸桿菌
2．1.5mL 離心管
3．槍頭、槍
(三)試劑
質粒小量制備試劑盒(3S Spin plasmid MIniprep Kit V3.1,申能博彩公司)

試劑盒的參考配方:
Solution I
50mmo1／L 葡萄糖
5mmo1／L 三羥甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0)
1.0 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
Solution II
0.4mo1／L NaOH，2％SDS(十二烷基硫酸鈉)，用前等體積混合
Solution III
5mo1／L 醋酸鉀 60 mL
冰乙酸 11.5mL
水 28.5mL
TE緩沖液
10mmo1／L Tris·HCl
1mmo1／L EDTA(pH8.0)
胰RNA酶(RNA酶A)
將RNA酶溶于10mmo1／L Tris·HCl(pH7.5)、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，保存于-20℃。

[實驗步驟]
(一)提取質粒
將3mL含Apm的LB液體培養基加入到兩支試管中，分別接入含pQE-31質粒和pUC18-CAT的大腸桿菌，37℃振蕩培養過夜。
以下的操作按試劑盒的說明書進行。(附試劑盒說明書)
(二)質粒的瓊脂糖凝膠電泳
將5mL洗脫液與3mL的DNA樣品緩沖液混合，加于1.2% Agarose 做凝膠電泳分析。

附：試劑盒說明書

3S Spin Plasmid Miniprep Kit V 3．1

試劑盒組成：
組成 K1910（50次） K1920（100次） K1930（250次） Solution I(a) 5m1 10m1 25m1 Solution II(b) 10m1 20m1 50ml Solution lll 20m1 50m1 2x50m1 Wash Solution (c) 22m1 2x22m1 5x22m1 TE(d) 5m1 10m1 40m1 3S Column 50支 100支 250支 Co11ection tube 50支 100支 250根 說明書 1份 1份 l份
注：
a)Solution I內含RNaseA，每次實驗結束后，4℃保存。
b)溫度低時，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保溫溶解，搖勻后使用。
c)使用前，必須在Wash Solution 瓶中加入50ml無水乙醇，充分混勾后使用。每次使用后將瓶蓋旋緊，以保持Wash Solution中的乙醇含量。
d)TE pH8．0或者水均可以用十洗脫，但是用水洗脫DNA，效率通常要低—些。抽提測序用質粒需要用水洗脫。
主要特點：
● 采用改良的堿裂解方法，質量穩定，重復性好。
● 經濟快速，每個抽提可以在20分鐘內完成。
● 無需酚抽提，無需乙醇沉淀，無需CsCl離心。
● 質粒純度高，洗脫體積小，適合于DNA全白動熒光測序。

實驗操作步驟(從細菌中抽提質粒)

1．將過夜培養的2m1細菌，測序用質粒抽提請用5m1細胞，高速離心1分鐘，*去除上清。
2．加入100ml solution I，用槍頭或振蕩器充分懸浮細菌。
注意：對于低拷貝數的質粒，請用5m1細胞；
質粒如果用于全自動熒光測序分析，請用5ml細胞，無需提高SolutionI，II和III的用量。
3．加入200ml Solution II，立即上下顛倒或用手指彈管底，使細菌裂解，室溫放置(2分鐘左右)至溶液變成澄清。
4．加入400ml Solution III，立即上卜顛倒5—10次，使之充分中和，室溫放置2分鐘。
注意：步驟2和3在冰上操作效果更佳。
5．高速離心，15，000轉／分鐘，10分鐘。無需低溫離心。
注意：提高離心速度，使沉淀更加緊密，步驟6操作取上清更為方便。
6．取出2m1樣品收集管和3S柱，在管壁標上樣品號，將步驟5中的上清全部轉移到(吸或倒入)3S柱里。蓋上離心管蓋子(蓋子也可以不蓋，但是如果您同時有很多樣品，擔心混淆或弄翻溶液，建議您蓋上蓋子)，室溫放置2分鐘 (室溫放置時間不重要，可長可短)；用臺式離心機室溫高速(12，000轉／分鐘)離心1分鐘。
注意：轉移上清時不要吸取沉淀，否則會出現Genomic DNA和蛋白質污染。
離心管蓋子蓋上時，柱子內壓的增加，可能會使部分溶液從柱子底部流出，為正常現象。
7．取下3S柱，棄去掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一支收集管中，吸取700ml Wash Solution到3S柱，離心1分鐘。
8．重復步驟7一次。
9．取下3S柱，棄去掉收集管中的廢液，將3S柱放入同—支收集管中，高速離心2分鐘。
10．將3S柱放入干凈的1．5m1的離心管中，在3S柱子膜中央加 50ml TE或水，不要蓋上離心管蓋, 室溫下放置2分鐘；蓋上離心管蓋，室溫高速離心1分鐘。
注意：將TE或水預熱到50℃左右可以提高洗脫效率。測序用質粒用30ml預熱的水洗脫，濃度一般滿足測序要求。
11．洗脫的質粒可以立即用于各種分子生物學操作或-20℃保存備用。lml過夜培養細胞，質粒如果用50ml水洗脫，通常情況下可以取10ml洗脫液做Agarose電泳或酶切分析。