外源DNA片段和線狀質(zhì)粒載體的連接，也就是在雙鏈DNA5'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質(zhì)粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成4個新的磷酸二酯鏈。但如果質(zhì)粒DNA已去磷酸化，則吸能形成2個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產(chǎn)生的兩個雜交體分子帶有2個單鏈切口，當雜本導入感受態(tài)細胞后可被修復。相鄰的5'磷酸和3'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的dna連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶。實際上在有克隆用途中，T4噬菌體DNA連接酶都是的用酶。這是因為在下沉反應條件下，它就能有效地將平端DNA片段連接起來。

DNA一端與另一端的連接可認為是雙分子反應，在標準條件下，其反應速度*由互相匹配的DNA末端的濃度決定。不論末端位于同一DNA分子(分子內(nèi)連接)還是位于不同分子(分子間連接)，都是如此。現(xiàn)考慮一種簡單的情況，即連接混合物中只含有一種DNA，也就是用可產(chǎn)生粘端的單個限制酶切割制備的磷酸化載體DNA。在瓜作用的底物。如果反應中DNA濃度低，則配對的兩個末端同一DNA分子的機會較大(因為DNA分子的一個末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率)。這倦，在DNA濃度低時，質(zhì)粒dna重新環(huán)化將卓有成效。如果連接反應中DNA濃度有所增高，則在分子內(nèi)連接反應發(fā)生以前，某一個DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA濃度高時，連接反的初產(chǎn)物將是質(zhì)粒二聚體和更大一些的寡聚體。Dugaiczyk等(1975;同時參見Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第2、3期合刊)從理論上探討了DNA濃度對連接產(chǎn)物性質(zhì)的影響。簡而言之，環(huán)化的連接產(chǎn)物與多聯(lián)體連接產(chǎn)物的比取決于兩個參數(shù)：j和i。j是DNA分子的一個末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度，j的數(shù)值是根據(jù)如下一種假設作出的：沉吟液中的DNA呈隨機卷曲。這樣，j與DNA分子的長度成反比(因為DNA越長，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作用)，因此j對給定長度的DNA分子來說是一個常數(shù)，與DNA深度無關。j=[3/(3πlb0)]3/2其中l(wèi)是DNA長度，以cm計，b是隨機卷曲的DNA區(qū)段的長度。b的值以緩沖液的離子強度為轉(zhuǎn)移，而后者可影響DNA的剛度。

i是溶液中所有互補末端的深度的測量值，對于具有自身互補粘端的雙鏈dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml這里No是阿佛伽德羅常數(shù)，M是DNA的摩爾濃度(單位：mol/L)。理論上，當j=i時，給定DNA分子的一個末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下，在反應的初始階段中，環(huán)狀分子與多聯(lián)體分子的生成速率相等。而當j>i時，有利于重新環(huán)化;當i>j，則有利于產(chǎn)生多聯(lián)體。圖1.9顯示了DNA區(qū)段的大小與連接反應混合物中j:i之比分別為0.5、1、2和5時所需DNA濃度之間關系(Dugaiczyk等，1985)。 現(xiàn)在考慮如下的連接反應混合物：其中除線狀質(zhì)粒之外，還含有帶匹配末端的外源dna片段。對于一個給定的連接混合物而言，產(chǎn)生單體環(huán)狀重組基因組的效率不僅受反應中末端的濃度影響， 而且還受質(zhì)粒和外源DNA末端的相對濃度的影響。當i是j的2-3倍(即末端的濃度足以滿足分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時)外源DNA末端濃度的2倍時，有效重組體的產(chǎn)量可達到zui大。這些條什下，連接反應終產(chǎn)物的大約40%都是由單體質(zhì)粒與外源DNA所形成的嵌合體。當連接混合物中線瘃質(zhì)粒的量恒定(j:i=3)而帶匹配末端的外源DNA的量遞增時，這種嵌合體在連接反應之末的理論產(chǎn)量。

涉及帶粘端的線狀磷酸化質(zhì)粒DNA的連接反應應包含：

1)足量的載體DNA，以滿足j:i>1和j:i<3。對一個職pUC18一般大小的質(zhì)粒，這意味著連接反應中應含有載體DNA為20-60μg/ml。

2)未端濃度等于或稍高于載體DNA的外源DNA，如外源DNA濃度比載體低得多，在效連接產(chǎn)物的數(shù)量會很低，這樣就很難別小部分帶重組抽粒的轉(zhuǎn)化菌落。這種情況下，可考慮采用一些步驟來減少帶非重組質(zhì)粒的背景菌落。如用磷酸酶處理線狀質(zhì)粒DNA或發(fā)跡克隆策略以便通過定向克隆的方法構建重組質(zhì)粒。

(二)粘端連接

1)用適當?shù)南拗泼赶|(zhì)粒和外源DNA。如有必要，可用凝膠電泳分離片段并(或)用堿性磷酸酶處理質(zhì)粒DNA。通過酚：氯仿抽提和乙沉淀來純化DNA，然后用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml。

2)按如下所述設立連接反應混合物：

a.將0.1μl載體DNA轉(zhuǎn)移到無菌微量離心管中，加等摩爾量的外源DNA。

b.加水至7.5μl，于45℃加溫5分鐘以使重新退炎的粘端解鏈，將混合物冷卻到0℃。

c.加入：10xT4噬菌體DNA連接酶緩沖液 1μl

T4噬菌體NDA連接酶 0.1Weiss單位

5mmol/L ATP 1μl

于16℃溫育1-4小時

10xT4噬菌體DNA連接酶緩沖液

200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)

50mmol/K MgCl2

50mmol/L二硫蘇糖醇

500μg/ml牛血清白蛋白(組分V.Sigma產(chǎn)品)(可用可不用)

該緩訓液應分裝成小份，貯存于-20℃。

另外，再設立兩個對照反應，其中含有(1)只有質(zhì)粒載體;(2)只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足，每個連接反應可用50-100ng質(zhì)粒DNA，并盡可能多加外源DNA，同時保持連接反應體積不超過10μl。可用至少3種不同方法來測定T4噬菌體DNA連接酶的活性。大多數(shù)制造廠商(除New England Biolabs公司外)現(xiàn)在都用Weiss等，11968)對該酶進行標化。1個Weiss單位是指在37℃下20分釧內(nèi)催化1mmol32P從焦磷酸根置換到[γ,β-32P]ATP所需酶時，1個Weiss單位相當于0.2個用外切核酸酶耐受試驗來定義的單位(Modrich和Lehman,1970)或者60個粘端單位(如New England Biolabs公司所定義)。因此，0.015Weiss單位的T4噬菌體DNA連接酶在16℃下30分鐘內(nèi)可使50%的λ噬菌體HindⅢ片段(5μg)得以連接。在本書中，T4噬菌體DNA連接酶一律用Weiss單位表示。par 目前提供的T4噬菌體DNA連接酶均為濃溶液(1-5單位/μl)，可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫蘇糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50%甘稀釋成100單位/ml的濃度置存。處于這種濃度并在這種緩沖液中的T4噬體DNA連接酶于-20℃保存3個月可保持穩(wěn)定。

3)每個樣品各取1-2μl轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。

(三)平端DNA連接

T4噬菌體DNA連接酶不同于大腸桿菌DNA連接酶，它可以催化平端DNA片段的連接(Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978)，由于DNA很容易成為平端，所以這是一個極為有用的酶學物性。有了這樣的物性，才能使任何DNA分子彼此相連。然而，相對而言，平端連接是低效反應，它要求以下4個條件：

1)低濃度(0.5mmol/L)的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981)。

2)不存在亞精胺一類的多胺。

3)*濃度的連接酶(50Weiss單位.ml)。

4)高濃度的平端。

1.凝聚劑

在反應混合物中加入一些可促進大分子群聚作用并可導致DNA分子凝聚成集體的物質(zhì)，如聚乙二醇(Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Harrison,1985)或氯化六氨全高鈷(Rusche和Howard-Flanders,1985),可以使如何取得適當濃度的平端DNA的總是迎刃而解。在連接反應中，這些物質(zhì)具有兩作用：

1)它們可使平端DNA的連接速率加大1-3個數(shù)量級，因此可使連接反應在酶DNA濃度不高的條件下進行。

2)它們可以改變連接產(chǎn)物的分布，分子內(nèi)連接受到抑制，所形成的連接產(chǎn)物一律是分子間連接的產(chǎn)物。這樣，即使在有利于自身環(huán)化(j:i=10)的DNA濃度下，所有的DNA產(chǎn)物也將是線狀多聚體。par 在設立含凝聚劑的連接反應時，下列資料可供參考。

(1)聚乙二醇(PEG8000)

1)用去離子水配制的PEG8000貯存液(40%)分裝成小份，冰凍保存，但加入連接反應混合物之前應將其融化并使其達到室溫。在含15%PEG 8000的連接反應混合物中，對連接反刺激效應zui為顯著。除PEG 800和T4噬菌體DNA連接酶以外，其他所有連接混合物的組分應于0℃混合，然后加適當體積的PEG 8000(處于室溫)，混勻，加酶后于20℃進行溫育。

2)連接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2時對連接反應的刺激效應zui為顯著，甚至ATP濃度略有增加或MgCl2濃度略有降低，都會嚴重降低刺激的強度(Pheiffer和Zimmerman,1983)。

3)濃度為15%的PEG 8000可刺激帶粘端的DNA分子的連接效率提高至原來的10-100倍，反應的主產(chǎn)物是串聯(lián)的多聯(lián)體。

4)PEG 8000可刺激短至8個核苷酸的合成寡聚物的平端連接，在這一方面，它與氯化六氨合高鈷有所不同。

(2)氯化六氨合高鈷

1)氯化六氨合高鈷可用水配成10mmol/L貯存液貯存于-20℃，它對連接反應的刺激具有高度的濃度信賴性。當連接反應混合物中鹽深度為1.0-1.5μmol/L時，其刺激作用zui大。氯化六氨合高鈷可使平端連接的效率大約提高到原來的50W部，但只能使端連接的效率提高到原來的5倍(Rusche和Howard-Flanders,1985)。

2)在單價陽離子(30mmol/L KCl)存在下，它對平端連接仍有一定的刺激作用，但此時連接產(chǎn)物的分布有所改變。連接產(chǎn)物不再是清一色的分子間連接產(chǎn)物，相反，環(huán)狀DNA將點盡優(yōu)勢。

3)與PEG 8000不同，氯化六氨合高鈷不能顯著提高合成寡核苷酸的連接速率。