1 基本原理

轉基因技術是當今生命科學研究領域zui基本的技術。利用轉基因技術改變物種的遺傳性狀,從而獲得新的品種或產品,則是包括基因工程在內的生物技術產業的主要研發內容。

在下面的小實驗中,我們將通過基因轉化的方法,把一種對氨芐青霉素敏感的大腸桿菌轉化成能抵抗氨芐青霉素的大腸桿菌。其基本原理是:細菌中存在一種環狀DNA,叫做質粒,它可以作為載體把外源基因(比如動物或植物的基因)攜帶到細菌中進行表達。如果它攜帶了抗氨芐青霉素的基因,那么被轉化到細菌就獲得了抗氨芐青霉素的遺傳性狀,這樣原來不能在含氨芐青霉素的培養基中生長的細菌也能在其中生長了。

一般情況下,往往把要在大腸桿菌中表達的外源基因插入在含有青霉素抗性的質粒中,以便于篩選出轉化的細菌。

2 實驗材料

1)感受態大腸桿菌(制備方法見附錄一)。

2)含有抗氨芐青霉素基因的質粒(制備方法見附錄二)。

3)含有氨芐青霉素的細菌固體培養基板(制備方法見附錄三)。

4)其他試劑:不含抗生素的細菌液體培養基(制備方法見附錄三)。

5)器具:1.5mL的塑料離心管、1mL的吸量管、滴管和橡膠吸頭、水浴鍋、碎冰塊、小型離心機、培養皿、涂布棒、接種環、高壓滅菌鍋、酒精燈、溫度計、酒精棉球、超凈工作臺(視條件而定,如房間干凈,也可直接在實驗臺上操作)。

3 基本步驟

1)在無菌條件下(酒精燈旁),向盛有50~100μL感受態大腸桿菌的塑料離心管中加入2μL質粒(濃度為1ng/μL),用滴管輕輕抽吸使之混合均勻,在冰上放置30min。

2)將離心管放入42℃水浴中熱激90s(此處需準確計時),然后迅速轉移到冰上,放置1~2min。

3)每管加入500LL無抗生素的細菌液體培養基,在37℃搖床以200r/min的轉速振搖1h,也可用手每隔幾分鐘顛倒離心管幾次。

4)將離心管放入小型離心機,以4000r/min的轉速離心10min,用吸量管吸去部分上清液,使離心管中的剩余液體約為100μL,然后用滴管輕輕抽吸離心管中的剩余液體,使沉淀在管底的細菌重新懸浮在液體中。用吸量管吸取這些細菌的懸浮液,放到含有氨芐青霉素的細菌固體培養基板上,用涂布棒將細菌懸浮液涂布均勻,蓋上培養皿,放置5min。

5)用與步驟4)相同的方法將沒有加入質粒的感受態大腸桿菌涂布在另一塊含有氨芐青霉素的細菌固體培養基板上。對兩塊平板要分別做好標記。

6)倒置培養基板,在37℃下培養12~16h。

7)觀察培養基板,比較上面生長的菌落數目。一般情況下,1ng質粒可獲得1000個轉化的細菌克隆(菌落)。

4 注意事項

1)操作之前應該洗手,然后用酒精棉球擦手。

2)實驗中使用的器具應高壓滅菌。

3)每一步操作都要注意無菌,在無菌操作臺內的酒精燈火焰附近進行操作。

附錄一 制備感受態大腸桿菌

1)從在37℃下培養了16~20h的新鮮平板上挑取1個單菌落,接種于5mL液體LB(LuriaBeriani)培養基中,在37℃的搖床中振搖培養12h后,按1∶100比例轉接于20mL液體LB中,37℃振搖培養至對數中期(約3h)。

2)將菌液轉移到1.5mL離心管中,在冰上放置10min。

3)在4℃下,以4000r/min的轉速離心10min,棄上清,加入原菌液13體積的用冰預冷的0.1molCaCl2溶液懸浮菌體,在冰上放置30min。

4)在4℃下,以4000r/min的轉速離心10min,棄上清,加入原菌液112體積和用冰預冷的0.1mol

CaCl2溶液,懸浮菌體,在冰上放置10min。

做好的感受態細胞可立即用于轉化,也可存于4℃冰箱,于1周內使用;或者加入20%體積的無菌甘油,存于-70℃超低溫冰箱備用。

附錄二 堿裂解法提取質粒

1)將2mL含有相應抗生素的LB培養基加入15mL的試管中,接入單菌落,在37℃下,以200r/min的轉速振搖培養過夜。

2)將1.5mL培養物轉入小塑料離心管中,離心棄去上清液。

3)向離心管中加入100μL在冰上預先冷卻的溶液Ⅰ,劇烈振蕩,使細菌沉淀和溶液Ⅰ混勻。

溶液Ⅰ:50mmol葡萄糖

10mmolEDTA(pH8.0)

25mmolTris·HCl(pH8.0)

4)加入200μL新配制的溶液Ⅱ,蓋緊離心管,迅速顛倒4~5次,在冰上放置5min。

溶液Ⅱ:0.2molNaOH

1%SDS

5)加入150μL預冷溶液Ⅲ,蓋緊離心管,顛倒混勻,冰上放置10min。

溶液Ⅲ(100mL):5mol/L乙酸鉀60mL

冰乙酸11.5mL

水28.5mL

6)將離心管放入小型離心機,高速離心后將上清液抽取到另一個干凈的小塑料離心管中。

7)向離心管中加入等體積氯仿(450μL),劇烈振蕩使上清液與氯仿混合成乳濁液,以12000r/min轉速離心10min。

8)離心后將上清液抽取到另一個干凈的小塑料離心管中,向上清液中加入2倍體積的無水乙醇,在4℃下沉淀20min,或在-20℃下沉淀10min,然后以12000r/min的轉速離心10min。

9)棄上清,向離心管中加入1mL70%酒精洗滌沉淀,棄去酒精后將沉淀晾干或用真空泵抽干。

10)用50μL含無DNA酶的胰RNA酶(20μg/mL)的無菌純水溶解沉淀,存于-20℃。對質粒作酶切,電泳分析進行鑒定。

附錄三 細菌培養基制備方法

1) 液體LB培養基(Luria-Bertani)

配制每升培養基,應在950mL蒸餾水中加入:

胰蛋白胨(bacto-trytone) 10g

酵母提取物(bacto-yeastextract) 5g

NaCl 10g

振蕩容器直至溶質*溶解,用5molLNaOH(約02mL)調節pH值至7.0,加入蒸餾水至總體積為1L,在15lbf/in2(1.034×105Pa)高壓下蒸汽滅菌2min。

如果需要加入抗生素,須在滅菌后待溫度降至50℃以下時在超凈臺中加入無菌的抗生素。

2)含有瓊脂的培養基(鋪制平板用)

高壓滅菌后前向前述的液體LB培養基中加入細菌培養用瓊脂(bacto-agar)15gL,在15lbf/in2(1.034×105Pa)高壓下蒸汽滅菌20min。從高壓滅菌鍋中取出培養基時輕輕振搖以混勻液體,當心液體過熱旋動可能會發生暴沸。當培養基溫度降至50℃左右時,在超凈臺中加入無菌的抗生素并旋動混勻培養基,避免產生氣泡。然后直接從燒瓶中把培養基倒入培養皿中。培養皿應事先高壓滅菌,90mm直徑的培養皿約需30mL培養基。

將培養基在超凈臺中吹至*凝固后,倒置儲存于4℃冰箱中備用。

說明:

1)感受態細菌也可按比例大量制備,然后分裝在0.5mL的塑料離心管中(每管50~100mL,如不考慮轉化率,減少實驗成本,感受態細菌用量可減少一半或更少一些),如果近期內便用,也可貯存在-20℃冰箱中。

2)感受態細菌和質粒均可向附近的科研單位索取或從生物試劑公司購置,實驗材料成本每人每次約5元。

3)考慮該實驗是生命科學研究和生物技術中zui基本的實驗技術,開設這一實驗課的難度不大,成功率高,操作中很多步驟還可以簡化。