一、實驗目的1了解并掌握培養(yǎng)基的配制、分裝方法；2掌握各種實驗室滅菌方法及技術。二、實驗原理 培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型，對營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機鹽、生長素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應用zui廣的凝固劑。加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反復融化，其凝固性降低。任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應及時*滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。三、實驗材料 1、器皿及材料 天平、稱量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管筒、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿盒、玻璃棒、燒杯、試管架、鐵絲筐、剪刀、酒精燈、棉花、線繩、牛皮紙或報紙、紗布、乳膠管、電爐、滅菌鍋、干燥箱。 2、藥品試劑 蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、瓊脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽計、磷酸銨、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。 3、流程 稱藥品→溶解→調(diào)pH值→融化瓊脂→過濾分裝→包扎標記→滅菌→擺斜面或倒平板。 四、實驗步驟 1 培養(yǎng)基的制備 1.1 稱量藥品 根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準確稱取各種藥品，放入適當大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。 1.2 溶解 用量筒取一定量(約占總量的1/2)蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。待各種藥品*溶解后，停止加熱，補足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待*溶化后，補足水分。 1.3 調(diào)節(jié)pH 根據(jù)培養(yǎng)基對pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)至所需pH。測定pH可用pH試紙或酸度計等。 1.4 溶化瓊脂 固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂*融化后才能停止攪拌，并補足水分(水需預熱)。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。 1.5 過濾分裝 分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞，引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。 1.6 包扎標記 培養(yǎng)基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。在包裝紙上標明培養(yǎng)基名稱，制備組別和姓名、日期等。 1.7 滅菌 上述培養(yǎng)基應按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時進行滅菌。普通培養(yǎng)基為121℃20min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。1.8 倒平板 將需倒平板的培養(yǎng)基，于水浴鍋中冷卻到45～50℃,立刻倒平板。2、滅菌方法 滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學滅菌法兩大類。本實驗主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。 加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內(nèi) 蛋白質(zhì)凝固變性，從而達到殺菌目的。蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固；同時濕熱的穿透力強，可增加滅菌效力。 2.1 濕熱滅菌 煮沸消毒法 ：注射器和解剖器械等均可采用此法。先將注射器等用紗布包好，然后放進煮沸消毒器內(nèi)加水煮沸。對于細菌的營養(yǎng)體煮沸約15～30min，對于芽孢則需煮沸約1～2h。 高壓蒸汽滅菌法：高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學實驗中zui常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設計的。當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15～30min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標本和工作服等都可應用此法滅菌。 2.2 操作方法和注意事項 加水：打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線。立式消毒鍋用已煮開過的水，以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存。注意水要加夠，防止滅菌過程中干鍋。 裝料、加蓋：滅菌材料放好后，關閉滅菌器蓋，采用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。 排氣：打開排氣口(也叫放氣閥)。用電爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當有大量蒸汽排出時，維持5min，使鍋內(nèi)冷空氣*排凈。 升壓、保壓和降壓：當鍋內(nèi)冷空氣排凈時，即可關閉排氣閥，壓力開始上升。當壓力上升至所需壓力時，控制電壓以維持恒溫，并開始計算滅菌時間，待時間達到要求（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121℃，20min）后，停止加熱，待壓力降至接近“0”時，打開放氣閥。注意不能過早過急地排氣，否則會由于瓶內(nèi)壓力下降的速度比鍋內(nèi)慢而造成瓶內(nèi)液體沖出容器之外。 滅菌后的培養(yǎng)基空白培養(yǎng)：滅菌后的培養(yǎng)基放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)24h培養(yǎng)無菌生長，可保存?zhèn)溆茫恍泵媾囵B(yǎng)基取出后，立即擺成斜面后空白培養(yǎng)；半固體的培養(yǎng)基垂直放置凝成半固體深層瓊脂后，空白培養(yǎng)。 2.2 干熱滅菌法 通過使用干熱空氣殺滅微生物的方法叫干熱滅菌。一般是把待滅菌的物品包裝就緒后，放入電烘箱中烘烤，即加熱至160～170℃維持1～2h。 干熱滅菌法常用于空玻璃器皿、金屬器具的滅菌。凡帶有膠皮的物品，液體及固體培養(yǎng)基等都不能用此法滅菌。 2.2.1 滅菌前的準備 玻璃器皿等在滅菌前必須經(jīng)正確包裹和加塞，以保證玻璃器皿于滅菌后不被外界雜菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用紙包扎或裝在金屬平皿筒內(nèi)；三角瓶在棉塞與瓶口外再包以厚紙，用棉繩以活結(jié)扎緊，以防滅菌后瓶口被外部雜菌所污染；吸管以拉直的曲別針一端放在棉花的中心，輕輕捅入管口，松緊必須適中，管口外露的棉花纖維統(tǒng)一通過火焰燒去，滅菌時將吸管裝入金屬管筒內(nèi)進行滅菌，也可用紙條斜著從吸管包起，逐步向上卷，頭端的紙卷捏扁并擰幾下，再將包好的吸管集中滅菌。 2.2.2 干燥箱滅菌 將包扎好的物品放入干燥烘箱內(nèi)，注意不要擺放太密，以免妨礙空氣流通；不得使器皿與烘箱的內(nèi)層底板直接接觸。將烘箱的溫度升至160～170℃并恒溫1～2h，注意勿使溫度過高，超過170℃，器皿外包裹的紙張、棉花會被烤焦燃燒。如果是為了烤干玻璃器皿，溫度為120℃持續(xù)30分鐘即可。溫度降至60～70℃時方可打開箱門，取出物品，否則玻璃器皿會因驟冷而爆裂。 用此法滅菌時，絕不能用油、蠟紙包扎物品。 2.2.3 火焰滅菌 直接用火焰灼燒滅菌，迅速*。對于接種環(huán)，接種針或其它金屬用具，可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進行滅菌。此外，在接種過程中，試管或三角瓶口，也采用通過火焰而達到滅菌的目的。 五、實驗結(jié)果 1、記錄各種不同物品所用的滅菌方法及滅菌條件（溫度、壓力等）。 2、試述高壓蒸汽滅菌的過程及注意事項。 六、思考題 1、制備培養(yǎng)基的一般程序是什么？ 2、做過本次實驗后，你認為在制備培養(yǎng)基時要注意些什么問題？ 3、滅菌在微生物學實驗操作中有何重要意義？ 4、試述高壓蒸汽滅菌的操作方法和原理。