食品安全檢測 PCR 進展及其應用
一. 實時熒光定量PCR技術的方法學
原理：
在real-time Q-PCR中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監測和連續地分析擴增相關的熒光信號，隨著反應時間的進行，監測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應早期，產生熒光的水平不能與背景明顯地區別，而后熒光的產生進入指數期、線性期和zui終的平臺期，因此可以在PCR反應處于指數期的某一點上來檢測PCR產物的量，并且由此來推斷模板zui初的含量。為了便于對所檢測樣本進行比較，在real-time Q-PCR反應的指數期，首先需設定一定熒光信號的域值，一般這個域值（threshold）是以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號（baseline），熒光域值的缺省設置是3～15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環數（Ct）。Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
熒光化學：
目前real-time Q-PCR所使用的熒光化學方法主要有五種，分別是：DNA結合染色，水解探針，分子信標，熒光標記引物，雜交探針。它們又可分為擴增序列特異和非特異的檢測兩大類。
食品安全檢測 PCR 進展及其應用1. 擴增序列非特異性檢測方法
該方法的基礎是DNA結合的熒光分子，如SYBR green 1等熒光染料。Real-time Q-PCR發展早期就是運用這種zui簡單的方法，在PCR反應體系中，加入過量SYBR green 1熒光染料，SYBR green 1熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號。熒光染料的優勢在于它能監測任何dsDNA序列的擴增，不需要探針的設計，使檢測方法變得簡便，同時也降低了檢測的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結合，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結合，使實驗容易產生假陽性信號。引物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線（melting curve）分析的軟件加以解決。
2. 擴增序列特異性檢測方法
在PCR反應中利用標記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產物，它又可分為直接法和間接法。食品安全檢測 PCR 進展及其應用
間接的方法就是利用水解探針的策略。目前在real-time Q-PCR中zui廣泛使用的TaqMan系統就是運用了這個原理。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團，此時5′端熒光基團吸收能量后將能量轉移給臨近的3′端熒光淬滅基團（發生熒光共振能量轉移，FRET），因此探針完整時，檢測不到該探針5′端熒光基團發出的熒光。但在PCR擴增中，溶液中的模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結合。在引物的介導下，沿模板向前延伸至探針結合處，發生鏈的置換，Taq酶的5′-3′外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）將探針5′端連接的熒光基團從探針上切割下來，游離于反應體系中，從而脫離3′端熒光淬滅基團的屏蔽，接受光刺激發出熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。
