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Human IFN ELISpot

閱讀:429發(fā)布時(shí)間:2015-6-25

Human IFN ELISpot

Human IFN-γ ELISpot操作指導(dǎo)

A. 準(zhǔn)備和預(yù)包被板的封閉(無(wú)菌操作)

1. 從密封的包裝袋中拿出ELISpot板,用無(wú)菌PBS洗4次(200?l/孔)。

2. 用10%血清的*培養(yǎng)基封閉(200?l/孔),室溫孵育30分鐘。

B. 細(xì)胞的孵育(無(wú)菌操作)

1. 倒掉培養(yǎng)基,加入細(xì)胞懸液并加入刺激因子,如抗原(終體積100-150?l/孔)。用mAb CD3-2 為陽(yáng)性對(duì)照。

2. 把板子放到37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育12-48小時(shí)。在此過(guò)程中不要移動(dòng)板子,并用鋁箔紙包上板子以避免邊緣效應(yīng)。 C. 斑點(diǎn)的檢測(cè) 1. 倒掉細(xì)胞,用PBS洗5次(200?l/孔)。 2. 用0.5%胎牛血清的PBS稀釋檢測(cè)抗體為1?g/ml,每孔加入100?l室溫孵育2小時(shí)。

3. 洗板5次。

4. 用0.5%胎牛血清的PBS 1:1000稀釋鏈霉親和素,每孔加入100?l室溫孵育1小時(shí)。

5. 洗板5次。

6. 通過(guò)0.45?m過(guò)濾器過(guò)濾底物(BCIP/NBT),每孔加入100?l,等待清晰的斑點(diǎn)形成。

7. 用自來(lái)水沖洗停止顯色,沖洗板子的后面。

8. 晾干板子。在顯微鏡下或用ELISpot計(jì)數(shù)儀對(duì)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。

9. 室溫避光儲(chǔ)存板子。注意:如果是未包被的板子,在使用之前需要包被抗體,包被過(guò)程為:

1. 用無(wú)菌PH7.4 PBS稀釋包被抗體濃度為15?g/ml。

2. 從密封的包裝袋中拿出ELISpot板,每孔加入50?l 70%乙醇預(yù)濕。預(yù)濕時(shí)間不要超過(guò)2分鐘。

3. 晃動(dòng)板子盡快吹干,用無(wú)菌水洗5次,200?l/孔。

4. 每孔加入100?l抗體溶液,4℃過(guò)夜。


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