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病毒致病機制的方法
閱讀：1262 發(fā)布時間：2016-1-4病毒在細胞內增殖，首先要進到細胞內，在細胞內合成大量子代病毒，再釋放到細胞外。此過程一般要經過吸附、穿人、脫殼、生物合成、裝配與釋放5個階段，又稱復制周期。經過病毒復制，宿主細胞發(fā)生變化。吸附是病毒與宿主細胞表面受體的結合階段，是構成感染的*步。通過細胞培養(yǎng)觀察病毒對細胞的致病變作用及用受體免疫血清阻斷病毒與受體作用是研究病毒致病機制zui常用的方法。
一、材料
1．細胞24孔培養(yǎng)板MAl04細胞單層。
2．病毒輪狀病毒，濃度為l00TCD。
3．細胞培養(yǎng)液RPMI 1640培養(yǎng)液。
4．TKS緩沖液 10mmol／L Tris—HCl，O．9％NaCl pH8．2。
5．Hank’s液。
二、方法
1．可溶性輪狀病毒受體制備大量培養(yǎng)的MAl04細胞，用11強洗2次，按lO7個／甜細胞濃度溶于1％NP一40的TBS緩沖液中，置4℃1h并每15m|n搖動搖1次，4℃3500r／min離心5分鐘，吸上清液于一70℃速凍，即為MAl04細胞可溶性受體。再經飽和硫酸銨沉淀及免疫親和層析法純化．即為純化受體蛋白。
2．受體蛋白免疫血清制備取BALB／C小鼠多只，皮下多位點注射純化受體蛋白，每位點4μg。于第2、3、5、6周每只鼠經尾靜脈加強注射受體蛋白4μg，第7周眼內眥靜脈取血分離血清，即為受體免疫血清。
3．細胞保護性試驗將MAl04細胞培養(yǎng)于24孔板，待細胞成層后，用Hank’s液將細胞洗2次，加入RPMIl640液3倍稀釋的受體免疫血清，每孔O．1ml，共4孔，同時設3種對照，即正常細胞、正常鼠血清及病毒對照，每對照4孔。于37℃作用1h后，各iL均用Hank’s液洗3次，并加入胰蛋白酶預處理的輪狀病毒，每孔O．1ml，于37℃作用1h后，加維持液至1ml，37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)24～一48h逐日觀察CPE。
三、結果分析
分析接種病毒24～48h后MAl04細胞cPE情況。如果正常鼠血清對照CPE為+++～++++；免疫血清實驗組CPE為一或±；單純病毒對照孔為+++～++++時，即說明受體免疫血清起到保護作用，可以阻斷病毒與細胞受體的結合，而使病毒不感染宿主細胞。