中文名稱：3D細胞培養凝膠試劑盒生產*
英文名稱：3D cell culture Kit
貨號：KC7186
保存條件：室溫
3D細胞培養凝膠試劑盒生產*概述
本品為生物活性凝膠，通過模擬活體內三維組織的微環境和形態結構，為細胞的體外培養以及體內實驗提供類似體內細胞外基質的三維立體微環境，支持各種細胞的三維生長。產品主要成分為多糖和人工多肽，不含抗原物質和動物源性成分，無免疫原性，產品穩定成分明確，
批次間差異小，實驗可重復性高，易于操作，僅需室溫操作，無需在冰上進行，本產品可以直接使用，無需稀釋或額外添加其他成分，僅需 2 步，孵育 5-10 min 即可形成細胞-凝膠的三維結構，凝膠剪切力敏感，可直接進行體內原位注射，無縫對接體內外實驗（與細胞混合
或者不混合均可），開展動物實驗。細胞可回收培養，附贈溫和裂解液，裂解或降解后的成分為單糖和氨基酸，對細胞無影響。高透光性，高通透性，方便實時跟蹤觀察，可熒光觀察、顯色觀察等。
說明書
操作說明：
1 使用前，將凝膠液預熱至 37℃。
2 在離心管中將凝膠液和細胞懸液輕輕混勻，可輕柔快速斡旋 1 秒鐘，重復 1-2 次。注：凝
膠和細胞混合時，必須嚴格按照說明書，先吸取凝膠，再往凝膠中加細胞懸液，混勻，順序
不可顛倒。斡旋時間不能超過 1 秒鐘，斡旋次數不能超過 3 次，過度斡旋會破壞細胞膜并增
加凝膠中的氣泡，從而影響細胞培養效果。建議的終細胞濃度為 4.2x10^5/ml-1x10^6/ml。
不同的培養體系請參照下表：
孔板 凝膠液體積 細胞懸液體積 培養基體積
96孔板 30ul/孔 30ul/孔 80ul/孔
24孔板 150ul/孔 150ul/孔 400ul/孔
12孔板 300ul/孔 300ul/孔 800ul/孔
6孔板 600ul/孔 600ul/孔 1600ul/孔
3 用 1xpbs 潤洗細胞培養板，然后快速貼壁加入凝膠細胞混合物，并于四周輕輕晃動，使凝
膠細胞混合物均勻鋪展。注：建議至少在凝膠形成之前 20 分鐘潤洗細胞培養板。
4 37℃孵育 5-30 分鐘以形成凝膠。
5 孵育完成后，沿孔壁加入培養液。37℃，5%CO2 條件下培養 24 小時。注：此期間避免晃
動培養板，以免破壞凝膠結構。
6 24 h后進行半換液（用移液槍輕輕吸取上層細胞培養液的1/2，再添加等量的新鮮培養液），
此后可正常換液。注意：*換液時一定要緊貼培養孔壁，小心吸取，避免吸掉剛貼附好的
細胞。
實驗中可能出現的問題和解決方法：運輸過程若出現氣泡，放置在 4 ℃冰箱，可自行消除，
如需快速消除，可微波加熱 30s。為避免使用過程中氣泡的產生，建議使用 1mL *
（去針頭使用）輕吸凝膠注入 EP 管中，也可用 PBS 潤洗的 1 mL 槍頭吸取凝膠，再將細胞懸
液加入后上下輕輕吹打即可混勻。2D 培養的細胞接種到凝膠中，需要 2-4 天適應凝膠的三
維環境，期間細胞生長狀態可能會比較保守（呈圓形）。之后，細胞即正常生長，可進行后
續實驗。為避免一些類型的細胞會從凝膠中遷移到培養皿底部貼壁，鋪板前先將孔板包被一
層薄薄的凝膠，即可解決問題。具體方法為：將凝膠和培養液體積 1:1 配置，鋪在孔板底
部，待凝固之后，再鋪凝膠細胞混合液。
細胞收集與再培養
回收凝膠中的細胞：
棄掉培養液，并用裂解液沖洗，加入凝膠液 5 倍體積的裂解液，輕輕吹打數次，室溫裂解約
10 分鐘，使凝膠*變成液體狀態，將混合液收集到離心管中，用 pbs 沖洗孔板并將收集
*述離心管中，1500 rpm 離心，3 min，即可收集到細胞。如果細胞在凝膠內是成團生長
的，可以在裂解時候加大裂解液體積，延長裂解時間以得到分散的單個細胞。
問題集：
1 3D細胞培養后如何染色？
答：3D細胞培養后可以直接在膠中進行染色，染色步驟同2D培養的細胞。不需要進行特殊處理。
2 3D細胞培養后怎么觀察？
答：3D細胞培養后可以使用Confocal或者熒光倒置顯微鏡進行觀察，光學顯微鏡也可以觀察，但是由于凝膠是立體結構，可能光學顯微鏡觀察的效果不會太理想。
3 你們的3D細胞培養凝膠能進行*培養嗎？
答：可以。
4 你們的3D細胞培養凝膠使用時需要使用配套的耗材或者儀器嗎？
答：不需要使用耗材和儀器。采用本試劑盒進行3D細胞培養時所用的耗材和儀器同2D培養。
5 你們的3D細胞培養凝膠試劑盒可以用于細胞共培養嗎？
答：可以進行細胞共培養。
6 你們的3D培養凝膠試劑盒是不是只能培養特定的一些細胞？
答：本試劑盒對細胞沒有選擇性，對大多數細胞都是適用的。
7 你們的3D培養凝膠試劑盒和Matrigel基質膠有何不同？
答：Matrigel基質膠主要是由層粘連蛋白,Ⅳ型膠原,巢蛋白,硫酸肝素糖蛋白等組成，是從腫瘤中提取出來的，成分復雜。本試劑盒凝膠主要是由多肽和多糖構成，為全人工合成的，無動物源性。適用Matrigel基質膠進行3D培養，其后期染色非常困難，細胞也無法回收。使用本試劑盒進行3D培養后的細胞可以輕松染色，并可以在保持細胞活性的情況下回收細胞。是您3D培養的理想選擇。
8 你們的3D培養凝膠和軟瓊脂一樣嗎？
答：我們的3D培養凝膠是人工合成的，其性能大大優于軟瓊脂。
9.凝膠和細胞懸液混合這一步，是否有順序要求？
答：有。必須嚴格按照說明書，先吸取凝膠到容器中，再往凝膠中加入細胞懸液，混勻。順序不可顛倒。否則不利于形成穩定的凝膠結構。
10.使用中如何吸取凝膠？
答：先將槍頭*剪掉，用 PBS 潤洗，然后再吸取凝膠。慢慢松開移液槍的按鈕，按鈕彈回原位之后，讓槍頭在凝膠液面以下稍多停留一會兒，再提槍，轉移凝膠到其他容器中。
11.吸取凝膠與混勻凝膠過程中，產生的氣泡可否消除？
答：吸取與混勻凝膠過程中產生的氣泡不能消除，會影響后續實驗，所以，應盡量避免氣泡產生。
12.怎樣達到更好的鋪板效果？
答：鋪板前，采用分區域逐滴滴加的方式，把每一滴凝膠按一定排布次序滴在孔（或皿）的不同區域，滴好之后，用槍頭在凝膠表面輕輕引流，可獲得較為均勻的鋪板結果。鋪板后將培養板靜置孵育 5-30min，期間不要晃動培養板。
13.何時*添加培養液？
答：37 ℃恒溫培養箱中孵育 5-30 min 形成穩定凝膠結構后即需要添加培養液。將培養液貼壁緩慢加入孔板中。
14.*培養需要如何換液？
答：換液前注意先將負壓泵壓力調低。培養 48 小時之后再進行*換液。換液時，棄掉2/3 左右的舊液即可，留少量舊液以避免吸走凝膠；生長快的細胞，24 h 時可以換掉一半培養液。*換液時一定要緊貼培養孔壁，小心緩慢吸取舊液，避免吸掉剛貼附好的細胞。添加新液一定要貼壁、緩慢加入，以避免沖壞凝膠。此后可根據細胞生長速度，視培養液的消耗情況來換液。
