肝細(xì)胞分離系統(tǒng)：

已發(fā)表的用于分離肝細(xì)胞的大多數(shù)傳統(tǒng)方法使用粗制和部分純化的酶制劑，包括各種類型的膠原酶和其他蛋白酶。

最近，使用具有更好特征的膠原酶制劑，例如 艾美捷 Worthington 1 型和 4 型 (CLS-1, 4) 提供了更好的結(jié)果。所有粗制膠原酶制劑都可能包含批次可變的污染蛋白酶、酯酶和其他酶，需要研究人員預(yù)先篩選幾批酶和/或不斷修改分離參數(shù)和方案。

艾美捷Worthington 肝細(xì)胞分離系統(tǒng)的開發(fā)旨在為研究人員提供可靠、方便和一致的肝細(xì)胞分離系統(tǒng)。通過使用該試劑盒中包含的預(yù)先優(yōu)化的酶組合，可以最大限度地減少批次間的差異并提高分離肝細(xì)胞的質(zhì)量。此外，Worthington 通過從成年大鼠中分離肝細(xì)胞對每批產(chǎn)品進(jìn)行使用測試，以確保活細(xì)胞的性能、可靠性和一致的產(chǎn)量。

該方法基于 Berry, MN 所描述的方法，由 Seglen, PO 修改（細(xì)胞生物學(xué)方法，第 XIII 卷，David M. Prescott 編輯，學(xué)術(shù)出版社，1976 年；第 4 章，“分離的大鼠肝細(xì)胞的制備"， pp 29-83），并與幾位研究人員一起進(jìn)一步優(yōu)化。 

穩(wěn)定性/儲存：試劑在環(huán)境溫度下在正常運(yùn)輸程序中預(yù)期的一段時間內(nèi)是穩(wěn)定的，但包裝在到達(dá)時應(yīng)冷藏。使用前，內(nèi)容物可在 2-8°C 下保存 4-6 個月。儲存在 2-8°C。

包裝內(nèi)容 該包裝包含足夠的材料，可用于五次單獨的成年大鼠肝臟灌注。對于更大或更小的組織應(yīng)用，請在每個步驟中準(zhǔn)備相應(yīng)體積的試劑，并按照協(xié)議中所述的相同比例將它們組合起來。

小瓶 #1：10X CMF-HBSS 濃縮液，1 瓶，500ml 無菌不含鈣和鎂的漢克CMF-HBSS。該溶液用于在加入解離酶溶液之前洗滌和灌注肝臟。

小瓶 #2：膠原酶-彈性蛋白酶小瓶，5 瓶 Worthington 膠原酶（代碼：CLS-1）和彈性蛋白酶（代碼：ESL），通過 0.22μm 孔徑膜過濾，并凍干。使用前，用 L-15/MOPS 溶液復(fù)溶，并按照以下步驟輕輕旋轉(zhuǎn)以溶解內(nèi)容物。將未溶解的小瓶儲存在 2–8°C。

3 號小瓶：每個 1,000 單位 DNase I，5 瓶 Worthington DNase I（代碼：D），通過 0.22 µm 孔徑膜過濾，并凍干。使用前，用 L-15/MOPS 溶液復(fù)溶，并按照以下步驟輕輕旋轉(zhuǎn)以溶解內(nèi)容物。將未溶解的小瓶儲存在 2–8°C。

小瓶 #4：0.15M MOPS，pH 7.5，1 瓶，75ml 0.15M MOPS，pH 7.5 緩沖濃縮液，用于緩沖重構(gòu)的 Leibovitz L-15 培養(yǎng)基。

 5 號小瓶：7.5% NaHCO3，1 瓶，100ml 7.5% 碳丨酸氫鈉濃縮液，用于緩沖稀釋的 CMF-HBSS。  

小袋，包含 Leibovitz L-15 培養(yǎng)基粉末，1 x 1L 通過切開信封頂部并將內(nèi)容物倒入含有大約 800 毫升細(xì)胞培養(yǎng)級水的燒杯中，重構(gòu)小袋的全部內(nèi)容物。用額外的 100 毫升水沖洗袋子 2 - 3 次。使總體積達(dá)到 1000 毫升并通過 0.22 微米孔徑的膜過濾。

灌注隔離所需但不包括在內(nèi)：  

• 用于動物麻醉和手術(shù)的設(shè)備和工具

• 帶有氣泡捕集器的灌注裝置，適用于10-30ml/min、37°C 的肝臟灌注。插入門靜脈的管子是薄壁的，內(nèi)徑為 0.35-0.45mm 注意：測量灌注回路的死體積

• 適用于肝細(xì)胞沉降的低速離心機(jī) • 用于細(xì)胞沉降、培養(yǎng)或孵育的實驗室器具，包括無菌 150 X 25mm 培養(yǎng)板

• 一種計數(shù)或估計細(xì)胞產(chǎn)量的方法 • 一種無菌過濾溶液的方法，如果需要的話

• 細(xì)胞培養(yǎng)基和用品（如果需要） • 無菌細(xì)胞培養(yǎng)級水

• 濃縮抗生素：如果需要，用于培養(yǎng)的Fungazone 等。

• 手術(shù)線，絲綢，000 號

• 肝素（可選）

 對于細(xì)胞定量和活力評估： • 改進(jìn)的 Neubauer 血細(xì)胞計數(shù)器 • 計數(shù)器 • 巴斯德移液器或微量移液器 • 顯微鏡 (10X)，最好是倒置相差 • 標(biāo)準(zhǔn) 10ml 血清移液器

注意：以下程序假定以前在肝臟消化和細(xì)胞分離方面的經(jīng)驗。對于那些沒有經(jīng)驗的人，請參閱上面提到的 Seglen 的出版物或 Alpini 等人的出版物。題為“Recent Advances in the Isolation of Liver Cells"的文章發(fā)表于 Hepatology (1994) 20:494-514。Berry, MN, Edwards, AM 和 Barritt, GJ；RH Burdon 和 PH Van Knippenberg, eds., Elsevier, Amsterdam,紐約，牛津，第 2 章，（1991 年）。  

一、1肝消化的初步步驟  

以下協(xié)議中指丨定的體積適用于大約 80-100ml 的灌注體積。對于不同的灌注系統(tǒng)，可能需要進(jìn)行比例調(diào)整。

注意：應(yīng)使用無菌技術(shù)、玻璃器皿和塑料器皿。還建議使用無菌罩以避免培養(yǎng)物污染。  

準(zhǔn)備：  

1 號瓶，10X CMF-HBSS：用 850 毫升無菌水稀釋 100 毫升 10X CMF-HBSS，并在 1 升無菌瓶中加入 4.7 毫升 7.5% （5 號瓶，NaHCO3）。如有必要，將 pH 值調(diào)節(jié)至 7.4。用無菌水使 (QS) 的總體積達(dá)到 1L。如果沒有無菌水，混合成分和無菌 (0.22u) 過濾器。總共5L。  

• Leibovitz L-15 培養(yǎng)基，1 x 1L：通過切開信封頂部并將內(nèi)容物倒入裝有 800 毫升細(xì)胞培養(yǎng)級水的燒杯中，重新配制袋中的全部內(nèi)容物。用額外的 100 毫升水沖洗袋子 2 - 3 次。使總體積達(dá)到 1000 毫升并通過 0.22 微米孔徑的膜過濾。  

 • 酶緩沖液：將 13.3ml MOPS 濃縮液與 10ml 無菌水和 76.7ml L-15 混合在一個 100ml 無菌瓶中。將足夠的 L-15/MOPS 轉(zhuǎn)移到每個小瓶 #2 和一個小瓶 #3 中以溶解內(nèi)容物，輕輕混合以*溶解并將酶轉(zhuǎn)移回 100 毫升瓶中。膠原酶、彈性蛋白酶和 DNase 的濃度分別約為 225U/ml、0.3U/ml 和 10U/ml。  

• 用CMF-HBSS 沖洗無菌灌注裝置，排除系統(tǒng)中的所有空氣，除氣泡阱中的空氣。  

• 將 150 x 25mm 或同等大小的培養(yǎng)皿放在灌注裝置附近以接收灌注的肝臟。

二、成年大鼠肝臟的灌注和消化  

以下步驟應(yīng)在層流罩或安全柜中執(zhí)行。特別是，消化的肝臟應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行處理，除非急性孵育會終止程序。

1. 用肝素對大鼠進(jìn)行預(yù)處理是有幫助的。灌注前約 20 分鐘腹腔注射，或在打開腹部后注入靜脈（Seglen 建議使用髂腰靜脈）。使用范圍為 100-200U/100g 體重。  

2. 麻醉一只體重 200-400g 的大鼠，并將其定位以進(jìn)行解剖。在大鼠下安裝足夠的襯墊以保持血液和初始灌注液。將老鼠放在它的背上, 用膠帶把腿貼下來, 用碘溶液或 70% 乙醇對腹部進(jìn)行消毒, 然后打開腹部露出肝臟。將腸子移到腹部的左側(cè)（當(dāng)你向下看時，老鼠的頭遠(yuǎn)離你，向右移動）暴露肝門靜脈。  

3. 使用一對細(xì)的彎曲鑷子，將一段 000 手術(shù)線放置在門靜脈下方和門靜脈周圍，就在門靜脈和靠近肝臟的最終腸系膜靜脈的交叉點上方（朝向頭部）。在靜脈周圍打一個松散的半方形或等效結(jié)。找到腔靜脈，以便在門靜脈 (vena porta) 被插管之前打開以進(jìn)行引流。   

4. 以 10-15ml/min 的流速打開含有普通 CMF-HBSS 的灌注泵，以便將管子或套管插入門靜脈。調(diào)節(jié)浴溫以使灌注液溫度為 37°C。在右腎附近的腔靜脈切一個切口以降低血壓，然后用細(xì)手術(shù)剪在門靜脈（部分穿過）在打結(jié)的線下方（朝向尾部）約 5 毫米處切一個切口。將管子插入門靜脈，朝向肝臟，距松結(jié)僅幾毫米。肝臟應(yīng)該沒有血液。將手術(shù)線緊緊地系在門靜脈和管道周圍。切開腔靜脈并將灌注液流速增加到 20-25ml/min。筆記：

5. 小心地從動物身上取出肝臟；不著急。將肝臟放在網(wǎng)狀舞臺上，使其可以以循環(huán)方式灌注。然而，最初的 CMF-HBSS 灌注液被浪費了。  

6. CMF-HBSS 灌注 7-10 分鐘后，轉(zhuǎn)用酶緩沖液（含有酶的 L-15 消化培養(yǎng)基）進(jìn)行灌注。在剩余 CMF-HBSS 的一個系統(tǒng)死體積被浪費后開始再循環(huán)。  

7. 用消化混合物灌注肝臟，直到它*膨脹（但不會過早）并且肝臟被*消化，大約需要 20-30 分鐘。注意：如果門靜脈破裂或肝臟表面在用鑷子或鈍物接觸時出現(xiàn)崩解跡象，請立即停止灌注并取出肝臟。

8. 灌注結(jié)束，停止泵，輕輕將肝臟置于 150ml 或等量的培養(yǎng)皿中，取出灌注管。如果尚未將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到無菌罩中，則向培養(yǎng)皿中加入大約 150ml 新鮮的 CMF-HBSS。   

9. 在培養(yǎng)皿中，用鑷子或狗梳（Seglen 推薦）輕輕撕下小葉囊膜，并耙出細(xì)胞。去除結(jié)締組織和血管組織的大中央樹，以及任何未消化的組織或結(jié)締組織。  

10. 輕輕攪拌培養(yǎng)皿以分散細(xì)胞。通過將一側(cè)支撐在蓋子上，將盤子傾斜放置。讓團(tuán)塊或結(jié)締組織靜置一分鐘左右，然后在板的最深處，即靠近下邊緣，從緩沖液頂部取出分散的細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到 50ml 無菌管中。  

11. 在室溫下低速離心 3 分鐘（對于松散的細(xì)胞團(tuán)塊來說足夠快，例如 100 xg）。  

12. 向培養(yǎng)皿中加入更多的 CMF-HBSS，重復(fù)該過程以增加細(xì)胞產(chǎn)量。只要可以去除干凈的細(xì)胞，就重復(fù)。

13. 細(xì)胞沉淀后，立即加入新鮮的 CMF-HBSS，倒置加蓋的試管以懸浮細(xì)胞，并按上述方法重新離心。再次重復(fù)該過程以從細(xì)胞中去除消化酶的痕跡。棄去上清液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基或第二個 100mm 或 150mm 培養(yǎng)皿中的緩沖培養(yǎng)基中。在離心機(jī)中溫和沉降后，良好消化 300 克大鼠肝臟的細(xì)胞產(chǎn)量約為 4-5 毫升填充體積。  

肝細(xì)胞培養(yǎng)（可選）

盡管特定于應(yīng)用，但肝細(xì)胞已在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，包括 DMEM、Leibovitz's L15、改良 Chee's 培養(yǎng)基、Williams E 培養(yǎng)基、RPMI 和 Waymouth's MB 752/1。一般來說，媒體都補(bǔ)充了許多因素，以保持差異化狀態(tài)。其中包括 EGF、胰島素、胰高血糖素和肝細(xì)胞生長因子（Chen 等，1998）。肝細(xì)胞專用培養(yǎng)基可從其他供應(yīng)商處購買。為了成功地培養(yǎng)肝細(xì)胞，培養(yǎng)器皿通常涂有基質(zhì)，例如膠原蛋白、層粘連蛋白或某種類型的商業(yè)基質(zhì)。

肝細(xì)胞培養(yǎng)的進(jìn)展包括使用膠原蛋白或 MatrigelTM 的三維基質(zhì)（凝膠）。陳等人。(1998) 將肝細(xì)胞鋪在 MatrigelTM (TMBecton Dickinson, Bedford MA) 上，幾周后取出細(xì)胞并將它們重新鋪在膠原凝膠上。24小時后，加入第二層膠原凝膠。或者，可以將細(xì)胞直接鋪板在膠原凝膠中并保持為三維培養(yǎng)物。

一篇綜述討論了培養(yǎng)變量對人類肝細(xì)胞的影響（Le Cluyse，2001），并且可能適用于其他物種的肝細(xì)胞培養(yǎng)。同一作者回顧了大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)的最佳條件（Le Cluyse 等，1996）。

Worthington主要研究覆蓋生物技術(shù)和生命科學(xué)研究，診斷，生物制藥和生物加工應(yīng)用的高質(zhì)量純化酶，蛋白質(zhì)，核酸和試劑盒。艾美捷科技是Worthington的中國代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。