古朵生物——免疫熒光的10種檢測(cè)方法

　　標(biāo)記免疫技術(shù)發(fā)展蕞早的一種是免疫熒光，它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)，通過(guò)將抗體與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光步驟包括，細(xì)胞固定和通透，封閉，孵育一抗，二抗等。除了這些基本步驟，接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)方法希望可以幫到您。

　　1. 細(xì)胞固定和通透

　　為達(dá)到蕞佳的檢測(cè)效果，細(xì)胞需要經(jīng)過(guò)固定和通透。步驟很重要，細(xì)胞和抗原需要保證蕞佳的結(jié)構(gòu)，并利于抗體與抗原結(jié)合。通常情況下，

　　2. 抗體特異性

　　免疫熒光需要用到特異性非常強(qiáng)的抗體，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結(jié)果。在大多數(shù)情況下，純化抗體的效果很好，但是正確的對(duì)照可以幫助精-準(zhǔn)定位抗原。使用只有二抗染色的片子作為陰性對(duì)照，有利于減少降低背景干擾。

　　3. 合適的抗體稀釋比例

　　通過(guò)優(yōu)化抗體稀釋比例來(lái)優(yōu)化染色，通常情況下 1ug/ml 的純化抗體或者 1:100-1:1000 的抗血清足夠達(dá)到特異性染色的結(jié)果。但在能保證低背景染色的前提下，可以通過(guò)增加濃度來(lái)提高信號(hào)強(qiáng)度。如果是第1次使用該抗體或測(cè)定某抗原，強(qiáng)烈建議濃度梯度實(shí)驗(yàn)。

　　4. 優(yōu)化緩沖液和封閉劑

　　盡管很多抗原在常見(jiàn)的 Buffer 如 PBS 中可以很好的被染色，但是對(duì)于某些目的抗原，更換一下含有不同離子的緩沖液，比如鈣、鎂、鉀等，可以帶來(lái)很大程度上的改善。Rockland 可提供優(yōu)化過(guò)的 IHC 用封閉緩沖液，同樣適用于熒光染色實(shí)驗(yàn)。

　　5. 選擇正確的二抗

　　如果您需要做免疫實(shí)驗(yàn)，我們強(qiáng)烈建議您選擇進(jìn)行過(guò)預(yù)吸附的二抗進(jìn)行單染實(shí)驗(yàn);如果是雙重甚至是多重染色，那么必須使用預(yù)吸附的二抗。同時(shí)，請(qǐng)優(yōu)先選擇來(lái)自同一物種的二抗。

　　6. 使用合適的細(xì)胞密度

　　選擇合適的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行染色，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量過(guò)多時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不好，導(dǎo)致染色背景深，低細(xì)胞密度，會(huì)使細(xì)胞貼壁不佳，狀態(tài)不好。

　　7. 多重染色

　　對(duì)同一樣本進(jìn)行兩個(gè)不同抗原的檢測(cè)時(shí)，可以用各自的抗體進(jìn)行同時(shí)染色，但要求兩個(gè)一抗的種屬來(lái)源不同，標(biāo)記物不同，而二抗的種屬來(lái)源需保持一致。

　　8. 降低背景

　　高背景是免疫熒光常見(jiàn)的問(wèn)題，解決此問(wèn)題可以用二抗來(lái)源的正常血清代替 BSA 做封閉液，降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)，洗滌至少三次，每次五分鐘，推薦洗滌液為 PBS+0.05%Tween。

　　9. 封片

　　作為免疫熒光的蕞后一步，可以提高折射率，保護(hù)樣品。

　　10. 數(shù)據(jù)分析

　　觀察整體樣片時(shí)，選擇具有代表性的細(xì)胞進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取與分析。

　　生物試劑 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營(yíng)宗旨;牢固樹(shù)立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向，不斷開(kāi)發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。