古朵：關于WB實驗的常見問題以及解決方案

　　主要從事免疫學、分子生物學和常規(guī)生化試劑的研發(fā)、銷售。并代理銷售Omega、Sigma、R&D、ATCC、HYCLONE等二十多家國外，致力于為廣大高校、科研院所和企事業(yè)單位提供*的科研試劑和完善的技術服務，滿足生物化學、分子生物學、細胞生物學、免疫學等生物科技實驗需求。

　　1、westernblot的優(yōu)點

　　答：靈敏，可達ng級，用Ecl顯色法理論上可達pg級。方便，特異性高。

　　2、為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白?

　　答：原因有很多:a)你的細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞;b)你的細胞中的蛋白質被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性;c)你的抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，看是否有問題。

　　3、我的細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢?

　　答：a)有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性*，可以適當提高SDS濃度，同時將樣品煮沸時間延長，b)也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。

　　4、我做的蛋白質分子量很小(10KD)，請問怎么做WB?

　　答：可以選擇0.2μml的膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其他按步驟即可。

　　5、我的目的帶很弱，怎么加強?

　　答：可以加大抗原上樣量。這是zui主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。

　　6、膠片背景很臟，有什么解決方法?

　　答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛龋淖円豢狗跤龝r間，提高牛奶濃度。

　　7、目標帶是空白，周圍有背景，是為什么?

　　答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象"。將一抗和二抗?jié)舛冉档停蚋鼡Q新底物。

　　8、我的膠片是一片空白，是怎么回事?

　　答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。

　　a)二抗的HRP活性太強，將底物消耗光;b)ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活;c)ECL底物沒覆蓋到相應位置;d)二抗失活。

　　9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?

　　答：a)可能是紅燈造成的,膠片本來就被曝光了，可以在*黑暗的情況下操作.看是否有改善.;b)顯影時間過長。

　　10、DAB好還是ECM好?

　　答：DAB有毒，但是比較靈敏，是HRPzui敏感的底物;ECM結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg級抗原。要看你實驗的情況

　　elisa試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術相關產(chǎn)品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發(fā)高質量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針