四色多重免疫熒光試劑盒Plus(兔鼠通用二抗)

　　原理介紹: 酪酰胺信號放大(TSA ，Tyramide signal amplification)技術是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶 蛋白進行標記的酶學檢測方法，類似常規免疫組化的 DAB 顯色方法 ，TSA 技術同樣采用 HRP 標記的二 抗，同樣有對應的“顯色 "步驟(HRP 催化加入反應體系的酪胺熒光素底物，產生活化熒光底物，活化底 物可與抗原上的酪氨s等殘基共價結合，使樣品上穩定的共價結合酪胺熒光素。之后用熱修復法或者抗體 洗脫液洗去非共價結合的一抗-二抗-HRP 復合物，重復下一種一抗-hrp 二抗來第二輪孵育，換另一種酪胺熒 光素底物，如此往復就可實現多重標記。

　　TSA 詳細原理是利用酪胺 Tyramide 的過氧化物酶反應(酪胺鹽在 HRP 催化 H202 下形成共價鍵結合位 點) ，產生大量的酶促產物，該產物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨s、組氨s和酪氨s酸殘基)結合，這樣在 抗原-抗體結合部位就有大量的熒光素沉積，結果使其檢測信號得到 10- 100 倍增強。簡單來說，用這種方法 做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的 HRP(而不是直接偶聯熒光素)，來催化后續添加入體系的非活性熒 光素。熒光素在 HRP 和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨s殘基共價偶聯，使得蛋白樣品與熒 光素穩定結合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理，前一輪非共價結合的抗體被洗掉，共價結合的熒 光素穩定共價結合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結束，熒 光素都結合好后，最后去檢測結果。 由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無需擔心抗體交叉反應， 以及一抗二抗種屬匹配問題，大大減少了實驗設計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說，如果用 TSA 技術，同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以 進行實驗，而且信號放大的倍數大大增強。本公司開發的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多 種：TYR-480Plus ，TYR-520Plus ，TYR-570Plus ，TYR-620Plus ，TYR-690Plus ，TYR-780Plus 。此試劑盒中 的熒光染料可單獨或配合使用。可以實現單標、雙標、三標以及更多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等 功能，極大豐富了此試劑盒的內涵。

　　四色多重免疫熒光試劑盒 試劑盒規格：100T

　　儲存溫度：4 度，一年有效

　　試劑盒組成：

　　名稱貨號規格保存條件

　　TYR-520Plus 熒光染料RC001濃縮型，50ul ，200x4℃

　　TYR-570Plus 熒光染料RC002濃縮型，50ul ，200x4℃

　　TYR-690Plus 熒光染料RC004濃縮型，50ul ，200x4℃

　　TSA bufferRCB008624mL4℃

　　HRP 山羊抗兔/鼠通用二抗RCB05415mL4℃

　　Dapi 染液(即用型)RC0510mL4℃

　　抗體稀釋液RCT00240mL4℃

　　3%過氧化氫RC01240mL4℃

　　染料使用方法：TSA 熒光染料反應液 =TYR-xxxPlus 熒光染料+TSA buffer;TYR-xxxPlus 熒光染料：TSA buffer=1：200;TYR-xxxPlus 熒光染料與 TSA buffer 的稀釋比例可以根據具體情況靈活調整優化，最佳范圍為 1:50-- 1:400(1:200 大部分情況能得到最佳結果);一般建議若一抗孵育時間常溫 1h-3h 內，建議稀釋比例 1:50- 1:200, 若一抗孵育時間 4 度過夜(12h 或以上)，建議稀釋比例 1:200- 1:400 或更高。

　　詳細操作步驟

　　1 、樣本準備：

　　1)石蠟切片：依次將切片放入二甲bⅠ15min-二甲bⅡ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-95%乙醇 5min-85%乙醇 5min-75%乙醇 5min ，蒸餾水洗。

　　2)冰凍切片：冰凍切片固定 10-30min，PBS 洗 5min，重復 3 次，滴加 0.3% triton-X100 破膜液通透 20min，PBS 洗 5min ，重復 3 次。

　　3)細胞爬片或者細胞涂片：細胞樣本固定 10-30min ，PBS 洗 5min 重復 3 次，滴加 0.3% triton-X100 破膜液通透 20min ，PBS 洗 5min ，重復 3 次。

　　2、抗原修復：組織切片置于盛滿 PH 9.0 EDTA 堿性抗原修復液或者 PH6.0 檸檬酸修復緩沖液的修復盒中于 微波爐內進行抗原修復(也可以用高壓 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min 等其他熱修復方法)。中 火 8min ，停火 8min ，轉中低火 7min ，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。 自然冷卻后將玻片置 于 PBS(PH7.4) 中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min 。(修復液和修復條件根據組織類型以及抗原類 型來確定，冰凍切片和細胞樣本可省略此步驟)。

　　3 、阻斷內源性過氧化物酶：切片放入 3%過氧化q溶液，室溫避光孵育 15 min ，將玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min。

　　4 、非特異性靶點封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，在圈內滴加用抗體稀釋液(或者其他封閉液 3%BSA 或者山羊血清)均勻覆蓋組織，室溫封閉 30min 。額外說明：抗體稀釋液內含有各種保護劑以及防腐劑，可以用來封閉 或者 稀釋一抗，稀釋后的一抗可以長期四度保存(在常溫下也可以保存一個月之久)

　　5 、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗 X ，切片平放于避光濕盒內 4°C孵育過夜或者 37 度 1-2h(濕盒內加少量水防止抗體蒸發);

　　6 、加 hrp 二抗：玻片置于 PBS(PH7.4) 中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后在圈內 滴加與一抗相應種屬的 hrp 二抗覆蓋組織，避光室溫孵育 50min ，PBS 洗三次。額外說明：本試劑盒內自帶 的 hrp 山羊抗兔/鼠通用二抗為即用型，具有超高靈敏度，隨時可用，無需配置。

　　7 、TSA 熒光染料反應液反應：濃縮型熒光染料與 TSA buffer 按照 1:50- 1:200 的比例混合均勻，切片滴加配 好的 TSA 熒光染料反應液均勻覆蓋組織室溫反應 1- 15min(最佳時間 5min- 10min)，PBS 洗三次(預實驗 可先染 1min洗干凈熒光染料后顯微鏡下觀察染色效果，如果陽性弱繼續滴加熒光染料加強染色強度直至合適強度后繼續進行下一步)。

　　8 、抗體洗脫：石蠟切片置于抗原修復液中 95 度水浴 25-40min(根據不同抗體親和力 靈活調整時間)或者 滴加適量 37 度預熱至溶解的mIHC 專用抗體洗脫液(冰凍切片 爬片 骨組織建議用)覆蓋樣本，37 度放置 5-20 分鐘，棄去洗脫液，再次滴加適量抗體洗脫液覆蓋樣本 37 度放置 5-20 分鐘，棄洗脫液，PBS 洗三次，每次 5 分鐘(石蠟切片可用熱修復洗脫或者抗體洗脫液洗脫，細胞及冰切切片需用抗體洗脫液進行洗脫)

　　9 、 重復 3-8 步驟(換用另外一種 TYR-XXXPLus 熒光染料)---第二輪標記

　　10 、重復 3-8 步驟(換用另外一種 TYR-XXXPLus 熒光染料)---第三輪標記

　　11、重復 3-7 步驟(換用另外一種 TYR-XXXPLus 熒光染料)---第四輪標記

　　12、DAPI 復染細胞核：玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后在圈內滴加 DAPI 即用型染液，避光室溫孵育 5min-20min。

　　13 、封片：玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片(我司有相應產品)。

　　14 、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統下觀察并采集圖像。

　　染料激發波長發射波長

　　DAPI 藍色350420

　　TYR-480Plus450480

　　TYR-520Plus 綠色490520

　　TYR-570Plus 紅色550570

　　TYR-620Plus590620

　　TYR-690Plus630690

　　TYR-780Plus750780

　　四色多重免疫熒光試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。