技術方法：熒光素FITC標記抗體的方法
 

　　常用Marsshall(958)法標記熒光抗體，也可以根據條件采用Chadwick等標記法或Clark等(963)的透析標記法。

　　1.Marsshall法

　　(1)材料 抗體球蛋白溶液、0.5mol/L(pH9.0)碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、%硫柳汞水溶液、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或3.0的0.0mol/LPBS等。

　　(2)方法及步驟

　　①抗體的準備 取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中，再加人生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使zui后免疫球蛋白濃度為20mg/ml，碳酸鹽緩沖液容量為總量的/0，混勻，將燒瓴置電磁攪拌器上(速度適當以不起泡沫為宜)5～0min。

　　②熒光素的準備 根據欲標記的蛋白質總量，按每毫克免疫球蛋白加0.0mg熒光色素，用分析天平準確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計算出免疫球蛋白、熒光素的量，還可以算出需加緩沖液的量。 a.蛋白溶液：含量Amg/m;容積Bml。 b.總蛋白量(AXB)=Crag。 c.C/20～C/0=Dmg(如蛋白含量低于20mg/ml，用C/0;如高于20mg/ml，用C/20)。 d.熒光素FITC的量：(/50～2/00)XC=Emg。 e.巳0.5mol/L(pH9.5)碳酸鹽緩沖液D/0=Fml。 f. PBS量D-(B+F)=Gml。 注：A為蛋白含量，mg/ml;B為蛋白質溶液的容積;C為蛋白總量，mg;D為常數，mg;正為熒光素的量，mg;F為碳酸鹽緩沖液的容積，ml;G為PBS的容積，ml。

　　③結合(標記) 邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于燒瓶壁(大約在5—0min內加完)，加完后，繼續避光攪拌2h左右。結合期間應保持蛋白溶液于4℃左右，故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。

　　④透析 結合完畢后，將標記的球蛋白溶液離心(2500r/min)20rain，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再置于燒杯中，用pH8.0緩沖鹽水透析(0～4~C)過夜。

　　⑤過柱 取透析過夜的標記物，通過葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進行鑒定。洗脫液：0.0mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2);過濾量：2ml標記蛋白液(過濾前未透析);收集量：20ml(稀釋.7倍左右)。

　　2.Chadwick法

　　(1)試劑和材料 抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%碳酸鈉水溶液、0.0mol/L pH8.0PBS、%硫柳汞、離心機及離心管、燒杯(25ml)攪拌器、無菌吸管，無菌吸管及毛細滴管、燒杯(500ml)透析袋等。

　　(2)方法及步驟

　　①抗體準備 用o～4~C的pH8。0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg/ml，置入25ml燒杯內，放于冰槽中。

　　②熒光色素準備 按每毫克免疫球蛋白加入熒光素0.0rug計算，稱取所需的熒光素，用3%碳酸鈉水溶液溶解。 ③將準備的抗體與熒光色素溶液等量混合，充分攪勻，在o～4~C冰箱中結合(在磁力攪拌機上持續攪拌)8～24h。

　　④透析和柱層析 方法同Marsshall法。

　　3.改良法

　　(1)試劑和材料

　　①0.0mol/L(pH7.2)PBS配法中，校定pH至7.2。NaCi 8g、Na2HP04 .5g，溶于2000ml蒸餾水

　　②0.5mol/L(pH9.0)碳酸鹽緩沖液配法 取0.5mol/LNazCOs(5.3%)0ml加入0.5mol/LNaHC03(4.2%)90ml，混合后，校定pH至9.0。

　　③3%碳酸鈉水溶液配法 稱L 5g充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。

　　④其他試劑和材料 l%疊d化鈉、離心機及離心管、燒杯(25m)、攪拌器、無菌吸管及毛細滴管、燒杯(500m)透析袋等。

　　(2)方法及步驟

　　①取價的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水(0.5mol/LNaCl)及緩沖液(0.5mol/LNaHC03—Na2C03，pH9.0)稀釋使每毫升內含蛋白質lOmg，緩沖液為總量的0%，降溫至4℃。

　　②加入異硫氰酸鹽(FITC)熒光素[蛋白：熒光素=(50—80)mg‘lmg]，在0～4~C下電磁攪拌2～4h。

　　③然后用半飽和的硫酸銨將標記球蛋白沉淀分離，除去未結合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨(用Nessler試劑測驗，至隔夜透析的鹽水無氨離子及熒光色素為止)。

　　④將制備好的熒光抗體加疊d化鈉o.0%，分裝在lml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，一20~C保存可達2年以上。

　　4.透析標記法 此法適用于小量抗體的熒光素標記，標記簡便，非特異性染色較少。試劑和材料 試劑和材料同改良法。

　　(2)方法及步驟 ①用0.025mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0，將欲標記免疫球蛋白稀釋成%濃度，裝入透析袋中。

　　②用同一緩沖液將FITC配成0.mg/ml的溶液，按0mg/ml球蛋白溶液體積的0倍，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內，并使透析袋浸沒于FITC液中。

　　③容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4~C電磁攪拌下透析標記24h。取出透析袋中標記液，即刻用SephadexG50凝膠過濾，去除游離熒光素，分裝，貯存于4℃中。

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