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細胞培養(yǎng)液在2500rpm/min 離心20分鐘后，收集上清即刻檢測， 或者分裝，-20℃貯存。避免反復凍融。
分離管分離血清。在1000g離心之前，使血樣凝集30分鐘。吸取血清樣本之后即刻檢測，或者分裝，-20℃貯存。避免反復凍融。
EDTA、ghsn或肝素抗凝收集血漿樣本。在血樣收集3分鐘內(nèi)離心收集樣本。即刻檢測，或者分裝，-20℃貯存。避免反復凍融。注：不要使用嚴重溶血或高血脂的樣本。所有樣本收集后，應及時分裝并貯存于-20℃。如果在24小時內(nèi)檢測，樣本可以存放在2 - 8℃。避免樣本的反復凍融。在分析前，冷凍樣本應該緩慢的恢復至室溫，輕柔地混勻。檢測前，樣本中可見的沉淀必須去除。
首先要清楚空白對照和陰性的區(qū)別：
空白對照：僅用稀釋液代替檢測樣本，用以觀察最終反應的顯色“本底"，并用于酶標儀消除、扣除“本底"，即以本底為“零’，讀取陽性、陰性對照孔和樣本孔的吸光值；
陰性對照：是本實驗檢測與待檢物有同源性和同質(zhì)性，又不含有待檢物質(zhì)，并能客觀比較和鑒別處理因素之間的差異。
如果顯色完成后，肉眼可見整板沒有顯示反應，可能原因及應對方法詳見下表。
| 序號 | 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 1 | 試劑盒儲存不當；不同試劑盒試劑混用 | 購買新的試劑盒，注意儲存條件；不可混用 |
| 2 | 孵育溫度低，時間短 | 如果溫度偏低，則延長孵育時間和顯色時間 |
| 3 | 錯加、漏加試劑 | 嚴格按照說明書步驟添加正確試劑 |
| 4 | 用于配置溶液的容器不干凈，或水有問題 | 使用干凈容器以及合格的蒸餾水 |
| 5 | 檢測抗體和/或HRP濃度太低 | 照說明書，不可隨意稀釋 |
| 6 | 試劑溫度不均一 | 所有試劑要室溫平衡 30 min |
| 7 | 洗板過程中浸泡時間長，洗板次數(shù)太多，洗板沖擊力大 | 嚴格按說明書操作 |
花板是指空白、陰性、陽性對照以及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標本孔的吸光度（OD 值）卻明顯偏高，可能原因及應對方法詳見下表。
| 序號 | 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 1 | 洗滌次數(shù)少，不充分 | 按說明書要求洗滌 |
| 2 | 底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB ）被金屬離子或氧化劑污染或曝光 | 配置時使用干凈容器以及合格蒸餾水；避光保存 |
| 3 | 孵育溫度高和/或時間過長 | 控制孵育和最后酶促反應的溫度和時間 |
| 4 | 加樣時未更換槍頭，造成交叉污染 | 每個樣都更換槍頭 |
| 5 | 附近孔交叉污染 | 洗滌時，洗液不可溢出孔洞，垂直拍板； 使用合適的拍板紙，避免孔內(nèi)進入紙屑塵渣； 孵育時封板要嚴密，防止陽性標本的液體蒸發(fā) |
| 6 | 樣本存在內(nèi)源性干擾物質(zhì) | 推測可能的感染物質(zhì)，并進行對應處理 |
| 7 | 樣本溶血、貯存過久、凝集不全、被細菌污染、采血管中添加物影響等 | 避免溶血、污染、過久儲存等現(xiàn)象 |
ELISA 實驗中標準品進行了倍比稀釋，但標準曲線最高點 OD 值偏高或偏低，且沒有梯度，可能原因及應對方法詳見下表。當然，也會存在酶標板封閉不足、本底不穩(wěn)定的情況。
| 結(jié)果 | 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 標曲最高OD太高（> 3.0） | TMB 孵育時間太長 | 調(diào)整孵育時間 |
| 指紋、雜質(zhì)影響 | 雙波長檢測，去背景 | |
| 標曲最高OD正常 | 標準品進行下一步稀釋前沒有混勻 | 先混勻，再移液 |
| 不同試劑盒或批號的試劑混用 | 不能混用 | |
| 檢測抗體濃度過高 | 按照說明書調(diào)整到最佳濃度 | |
| 孵育時未加蓋導致?lián)]發(fā)和污染 | 貼封片或加蓋 | |
| 孔間污染 | 加樣及洗板時防止孔間污染 | |
| 標曲最高點OD低（< 0.8） | 顯色時間不夠 | S1、S2深藍色，梯度明顯，S5有淡藍色時可終止 |
| 粉末標準品未充分溶解 | 粉末標準品按說明書加一定體積的液體后，輕柔混勻，室溫靜置 30 min，充分溶解 | |
| 標準品反復凍融 | 標準品反復凍融后活性降低；購置新的標準品 | |
| 孵育溫度、時間 | 所有試劑室溫（~25 ℃）平衡 30 min，孵育時間按照說明書指示 | |
| 洗滌浸泡時間過長 | 按照說明書操作，勿人為增加浸泡時間 | |
| 酶標板在貯存或洗后拍干時過分干燥 | 防止板過于干燥 | |
| 不同試劑盒或批號的試劑混用 | 不能混用 | |
| 顯色液變質(zhì) | 更換新的顯色液 |
ELISA 實驗中標準品進行了倍比稀釋，但標準曲線最高點 OD 值偏高或偏低，且沒有梯度，可能原因及應對方法詳見下表。當然，也會存在酶標板封閉不足、本底不穩(wěn)定的情況。
此外，如果肉眼觀察酶標板顯色正常，而上機所測 OD 異常，可檢測酶標儀參數(shù)的設(shè)定以及濾光片是否匹配。洗滌液多為非離子型中性緩沖液，既含有親水集團，也含有疏水基團，可以使吸附在酶標板上的蛋白解離而溶于水中，去除非特異性吸附物質(zhì)，但是濃度太高時，會引起包被抗體脫落。所以需要正確稀釋。同時應該用高質(zhì)量的純凈水稀釋，不能引入別的離子，以免對抗原抗體結(jié)合和酶促反應產(chǎn)生影響。
| 序號 | 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 1 | 樣品不適合做 ELISA 檢測 | 樣品一般選擇培養(yǎng)上清、血清、血漿。其他樣品形式可能不適合做 ELISA 檢測或者需要優(yōu)化檢測的條件（例如稀釋液的成分） |
| 2 | 樣本含量低于靈敏度 | 濃縮樣本或使用高敏試劑盒，避免反復凍融 |
| 3 | 樣本存于吸附性強的試管中 | 選擇蛋白吸附能力低的硅化 EP 管 |
| 4 | 凍融后，蛋白凝集，分布不均 | 樣本避免反復凍融 |
上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。古朵試劑盒
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