免疫細胞或組織化學染色的相關問題

　　附上我們這里的組化步鄹：(切片復溫涼干完畢)：

　　1。加入配好的0.3%的過氧化氫甲醇溶液(甲醇80ml+0.01MPBS 20ml+30%過氧化氫 1ml)30min，以消除內源性過氧化物酶的影響，0.01MPBS清洗5min×3;

　　2。加入配好的0.3% Triton X100(30% Triton X100 1ml+0.01MPBS 100ml)30min，以增加細胞的通透性，0.01MPBS清洗5min×3;

　　3。加入用血清稀釋液(牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS 100ml+疊氮納0.08g+30% Triton X100 1ml)稀釋的*抗體4℃反應24-48h。吸去抗體，0.01MPBS洗5min×3;

　　4。加入血清稀釋液或0.01MPBS稀釋的二抗，室溫孵育2h。吸去二抗，0.01MPBS洗5min×3;

　　5。加入ABC復合物，室溫孵育2h，0.01MPBS洗5min×3，蒸餾水迅速沖三次;

　　6。加入硫酸鎳銨溶液(DAB 25mg+蒸餾水50ml+硫酸鎳銨醋酸緩沖液50ml+葡萄糖200mg+氯化銨40mg+葡萄糖氧化酶1mg)，進行免疫細胞化學顯色，時間不超過30min。不時在顯微鏡下進行觀察，待細胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液，蒸餾水迅速沖三次后加入0.01MPBS終止反應;

　　或直接加入配好的DAB溶液進行顯色。

　　7。梯度酒精(70%、80%、90%酒精5min×1，95%酒精5min×2，100%酒精5min×3)脫水之后，二甲苯透明，中性樹脂封片。

　　而對培養的細胞則比較簡單：(細胞種在玻片上)

　　1。固定液固定10-30min，0.01MPBS清洗2min×3;

　　2。羊血清封閉液封閉(可以加入0.3% Triton X100 )30-60min分鐘;

　　3。加入用血清稀釋液(牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS 100ml+疊氮納0.08g+30% Triton X100 1ml)稀釋的*抗體室溫反應1-2h或4℃過夜。吸去抗體，0.01MPBS洗2min×3;

　　4。加入血清稀釋液或0.01MPBS稀釋的二抗，室溫孵育1h。吸去二抗，0.01MPBS洗2min×3;(如果是熒光二抗就可以直接用50%甘油封片，進行觀察了)

　　5。加入ABC復合物，室溫孵育1h，0.01MPBS洗2min×3，蒸餾水迅速沖三次;

　　6。加入硫酸鎳銨溶液(DAB 25mg+蒸餾水50ml+硫酸鎳銨醋酸緩沖液50ml+葡萄糖200mg+氯化銨40mg+葡萄糖氧化酶1mg)，進行免疫細胞化學顯色，時間不超過30min。不時在顯微鏡下進行觀察，待細胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液，蒸餾水迅速沖三次后加入0.01MPBS終止反應;或直接加入配好的DAB溶液進行顯色。

　　7。梯度酒精(70%、80%、90%酒精5min×1，95%酒精5min×2，100%酒精5min×3)脫水之后，50%明膠封片。

　　1。脫片--

　　a)切片和貼片一定要過關;

　　b)冰凍切片從冰箱中拿出必須復溫并涼干(室溫1-2h);

　　c)清洗切片時應放在切片缸內，沿缸壁倒入PBS，靜置5-10min，沒有晃動的必要。

　　2。染色背景太深，而且沒有陽性顯色--

　　a)灌注要要過關;

　　b)需用3%雙氧水甲醇溶液浸泡切片;

　　c)需用0.3-0.4%的triton溶液浸泡切片;

　　d)延長羊血清封閉時間;

　　e)降低一抗的濃度;(我有一次就是用了較高的一抗濃度，結果沒有染出東西，但是降低一抗濃度后，結果非常好，其實這就是抗體的“prozone"--前區現象)

　　3。蘇木素復染

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