理論上應使用超純水，但在實際操作中，應根據不同的儀器要求、具體的實際情況靈活掌握。
理想的HPLC用水應為18.2mΩ/cm的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機物、無機離子及CO2等。
MS檢測器的要求。從實際使用的效果看，市售優質純水或蒸餾水，如果水質新鮮，再過濾可以滿足四極桿HPLC-MS檢測的基本要求，但易受瓶子中塑料添加劑的污染。而對于研究級的飛行時間質譜的HPLC-MS，只有新鮮的超純水才能滿足分析的要求。
近些年來逐步普及的ELSD檢測器，由于其特點，水中的顆粒將直接影響儀器的靈敏度和噪音，使用超純水。
對于UV和DAD檢測器，經過二次處理的各種水再過濾和脫氣基本可以滿足分析要求。如果水質好，不過濾和脫氣一般問題也不大，有時去離子水也可勉強使用。從波長來看，低波長分析用水高于高波長分析的用水，梯度分析用水高于等度分析用水，尤其在紫外較底波長時，使用超純水，否則極易出干擾峰，影響整個色譜圖的質量。
示差和熒光檢測器由于其靈敏度和 性，其用水比紫外要求還可以低一些。
除了從儀器的性能特點考慮外，不同使用部門，對水的要求也不盡相同，如質量監督部門應使用專門的儀器用水，有嚴格的質量保證，具有可溯源性。HPLC用水可以通過專門的純水機或超純水機來得到。按用途，超純水可以分為二個大類，儀器專用和生物培養專用，儀器用的超純水高配置的除了交換柱外，還有紫外燈和0.22um過濾頭二個可配附件。由于其交換柱、過濾頭、紫外燈是一次性消耗，成本，但質量保證，使用方便。去離子水重蒸，將去離子水經石英蒸溜或亞沸后使用，注意不能將所有水都蒸出來，蒸出3/4為宜，剩下的因離子和雜質含量高棄去，否則重蒸將行同虛設。二次或三次重蒸水，具體方法同上差不多，由于不同地區自來水初始的水質差別很大，出水率自己判斷，同時要經常清洗，質量比較難控制。采用類似家用的純水機，其采用反滲膜系統，出水率約70％，離子除去率在95％以上，水質略低于去離子水，后面加一個陰陽交換樹脂，出水可達到15mΩ/cm，過濾后水質不低于市售的純水或蒸餾水，使用方便。市場上桶裝的純凈水或蒸餾水，水在1－10mΩ/cm之間，選擇質優的產品基本可以滿足HPLC分析要求，也不一定要過濾。
有些生產單位自己有類似級別的水如注射用水、電子廠的清洗水、鍋爐蒸餾水等，過濾后可以直接使用。不管采用何種途徑，配制流動相應用新鮮水，水質越高放置時間越短。
