在反相色譜中,甲醇和乙腈是的二種有機試劑，由于二者性質的差異，在使用中有一定的區別。
1價格，乙腈高于甲醇
在分析成本上，HPLC級的乙腈，價格比HPLC級的甲醇高的多。因此，一般的液相色譜分析有機試劑甲醇為多。但文獻所示的條件多用乙腈。
2吸光度，乙腈低于甲醇
所謂的HPLC級是指除去具有吸收UV的物質,其在規定的吸收波長上的吸光度小于規格值,但并不是指的純度高。
從這四種試劑的吸收光譜看，HPLC級的乙腈吸收最小，尤其在低波長上。因此在UV檢測時，其產生的噪音最小，在低波長尤其明顯。所以在UV的低波長上，高靈敏度檢測用HPLC的乙腈最合適。另外，在UV的梯度檢測上，HPLC的乙腈產生的鬼峰最少，同時由于其低的吸收值，梯度變化其吸收值變化最小，較大范圍內的反相有機試劑梯度用HPLC乙腈宜。
甲醇的HPLC級和優級的吸收光譜相差不大，但優級不能保證吸光度，因此還是盡量使用HPLC級。
3壓力，乙腈低于甲醇
色譜柱內的壓力，同很多因素有關，包括長度、內徑、顆粒大小、填料性質、流速、溫度及流動相等。但在實際分析過程中，影響壓力變化主要是流動相中有機溶劑和緩沖液混合比例的不同，圖中表示了水/乙腈，水/甲醇混合液的比例與壓力的關系。從圖中可以看到，甲醇與水混合壓力增高，而乙腈同樣與水混合并不如此，乙腈明顯優于甲醇。同時我們也看到溫度對壓力的影響，溫度升高，壓力下降。
4流動相脫氣，乙腈要注意
這里只討論預先混合的流動相配置問題。甲醇與水混合時會發熱，溫度升高，多余溶解的空氣較易變為脫出氣泡，容易脫氣。而乙腈與水混合是吸熱反應，隨著溫度慢慢回到室溫，產生氣泡，所以要考慮脫氣。
5洗脫強度，一般而言，乙腈大于甲醇
乙腈和甲醇與水混合二者比例相同，一般情況下，乙腈的洗脫能力強，尤其是混合比例低時。例如從和的洗脫看，相同的保留時間，乙腈的比率只需甲醇的一半都不到，而另一方面，當有機溶劑100％或與此非常接近時，對于胡蘿卜素和膽甾醇來看，甲醇的洗脫能力往往比乙腈強。
6分離選擇性，有差異
乙腈和甲醇在分離的選擇性上有一定的差異，尤其是極性或離子化合物，出峰次序往往會不一致。在圖4中，和苯甲酸的洗脫次序改變。這是由于有機溶劑的化學性質不同所致（甲醇是質子性，乙腈是非質子性）。因此，當用乙腈（甲醇）不能獲得良好分離時可以試試甲醇（乙腈）。
7峰形，有時出現差異
對于像水楊酸化合物等，用乙腈時脫尾大，用甲醇則可抑制脫尾。這是由于對于硅表面與目標成分有相互作用的流動相的有關方，因有機溶劑分子的化學性質不同而異，或者是對成分溶解能力的差異所造成的。
可是，一般情況下，聚合物反相柱在使用甲醇時比硅膠柱更具有峰形寬的傾向，特別是用聚苯乙稀柱分析芳香族化合物時常見，而用乙腈則效果好的多。
8結論
總之，對于反相色譜中常用的乙腈和甲醇，一般情況下使用HPLC乙腈，但用乙腈達不到效果時，可以試試HPLC級甲醇。
