siRNA質粒載體構建技術
RNAi （RNAinterference, RNA干擾）技術，即將與內源 mRNA 編碼區(qū)同源的小片段（19 －23bp）外源雙鏈 RNA（double s`tranded RNA ）導入細胞中，通過一系列細胞內反應引發(fā)細胞中相應 mRNA 的降解，從而導致特定基因表達沉默的一種技術。RNAi的作用提供了一種經濟、快捷、的抑制特異基因表達的技術手段，有助于研究該基因在生物模型系統(tǒng)中的作用，是研究基因功能的重要工具，并且逐步成為病毒性疾病、遺傳性疾病以及腫瘤等的基因治療研究的一種手段。
基本原理示意圖
siRNA構建技術服務
本公司提供siRNA 載體的構建服務，siRNA 載體可以在細胞內直接轉錄出 shRNA ，其干擾效果等同于siRNA ，而且能夠解決 siRNA干擾時間短的缺點。您只需提供需干擾基因的詳細信息，包括基因的 mRNA 序列，Genbank Accession No. 和所屬物種，本公司負責設計3條針對目的mRNA的siRNA 靶序列，在短時間內構建三個可用于目的mRNA干擾實驗的siRNA 載體。可以為您節(jié)省大量的時間與精力。此方法是多種siRNA制備方法中*可以進行長期基因沉默研究的方法。
閃晶生物siRNA載體構建服務程序：
1. siRNA表達載體的選用：
本公司選用的siRNA 表達載體含*抗性基因和GFP綠色螢光標記，可以建立穩(wěn)定表達系，同時可以實時監(jiān)測載體在細胞中的轉染效率。載體中還含有Amp抗性基因，可以無限擴增。
2. 設計siRNA靶序列
A 、根據目的mRNA序列，設計3條RNA干擾靶序列，靶序列一般為19 － 21nt 長。
B 、對于每條選定的siRNA 靶序列，設計 siRNA 正義鏈和反義鏈，以 loop（9nt） 相連，稱為 shRNA（short hairpin RNA）。
C、陰性對照的設立.
3. 合成模板：
合成每條編碼 shRNA的DNA 模板的兩條單鏈，退火 DNA 單鏈得到 shRNA 的 DNA 雙鏈模板。模板鏈后面接有RNA PolyIII聚合酶轉錄中止位點，同時兩端分別設計 BamHI 和 HindIII 酶切位點，可以克隆到 siRNA 載體多克隆位點的 BamHI 和 HindIII 酶切位點之間。
4. siRNA 空載體用BamHI和HindIII雙酶切后，1 ％瓊脂糖凝膠電泳，回收線性載體。
5. 連接與轉化：
把退火的DNA模板雙鏈連接到線性載體中。采用T4連接酶，插入片斷與載體的摩爾比約為 3 ： 1 。連接產物轉化DH5α大腸桿菌，在LB Amp培養(yǎng)基上涂板，37 ℃培養(yǎng)過夜。
6. PCR 鑒定
7. 測序鑒定
8.柱抽提陽性克隆載體并定量。
