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動物肝臟DNA的提取與純化

2015-11-11  閱讀(1684)

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原理

生物體組織細胞中的大部分脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)與蛋白質結合,以核蛋白——脫氧核糖核蛋白(DNP)和核糖核蛋白(RNP)的形式存在,這兩類中復合物再不同的電解質溶液中的溶解度有較大差異。在低濃度的NaCl溶液中,DNP的溶解度隨NaCl濃度的增加而逐漸降低,當NaCl濃度達到0.14mol/L時,DNP的溶解度約為純水中溶解度的1%(幾乎不溶);但當NaCl濃度繼續升高時,DNP的溶解度又逐漸增大,當NaCl濃度增至0.5mol/L時,DNP的溶解度約為純水中溶解度的2倍(溶解度很大)。而RNP則不一樣,它在弄NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此,可以利用不同濃度的NaCl溶液將DNP和RNP分別抽提出來。

將抽提得到的DNP用十二烷基硫酸鈉(SDS)處理,DNA即與蛋白質分開,可用氯仿-異丙醇將蛋白質沉淀除去,而DNA溶于溶液中,加入適量的乙醇,DNA即析出,進一步脫水干燥,既得白色纖維狀的DNA粗制品。為了防止DNA(或RNA)酶解,提取時加入乙二胺四乙酸(EDTA)。大部分多糖在用乙醇或異丙醇分級沉淀時即可除去。


方法

1、DNA的提取:

a.稱取新鮮動物的肝臟(如豬肝)約10g,于研缽中,在冰浴中剪碎,加2倍組織重的冷的0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液(約20ml)研磨成漿狀,得勻漿液。

b.將勻漿液(除去組織碎片)于3000r/min離心10分鐘,棄去上清液,收集沉淀(內含DNP),沉淀中加兩倍體積的冷的0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液,攪勻,如前離心,重復洗滌2~3次。所得沉淀為DNP粗制品,移至燒杯中。


2、DNA的純化:

a.取粗品DNA,加入5μl RNA酶,用玻璃棒慢慢攪拌20分鐘。

b.向沉淀中加入冷的0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液,使總體積達到20ml,在緩慢攪拌的同時滴加25%的SDS溶液1.5ml,邊加邊攪拌,此步驟使核酸與蛋白質分離。

c.加入2mol/L NaCl溶液 5ml,使NaClzui終濃度為1mol/L,攪拌10分鐘(速度要慢)。溶液變得黏稠并略帶透明。

d.加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇混合液,于冰浴中攪拌20分鐘,3000r/min離心10分鐘。分層,上層為水相(含DNA鈉鹽),中層為變性的蛋白沉淀,下層為苯酚/氯仿/異戊醇混合液。

e.用吸管小心地吸取上層水相,棄去沉淀,再在相同條件下重復抽提2~3次。

f.取上清液放入干燥小燒杯中,加入2倍體積預冷的95%乙醇。加乙醇時,用滴管吸取乙醇,邊加邊用玻璃棒慢慢順一個方向在燒杯內轉動,隨著乙醇的不斷加入可見溶液出現黏稠狀物質,并能逐步纏繞與玻璃棒上,此時玻璃棒攪動的目的在于把黏稠絲狀物纏在玻璃棒上,直至再無黏稠絲狀物出現為止。黏稠絲狀物即是DNA。

g.用2ml 80%乙醇洗滌沉淀物1次。

h.室溫干燥,直到附于玻璃棒的殘余液滴干凈。

i.用1~2ml TE重新溶解沉淀物,然后置于4℃或-20℃保存備用。

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