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如何有效完成CRISPR實驗！
生物學家們總是沉迷于對基因組修修補補，而其中一種近期紅得發紫的技術就是 CRISPR。自2012年CRISPR/Cas 作為一種基因組編輯工具登臺以來，關于這種技術的論文數量就大幅增加，的證明之一就是2015年兩位科學家由于在CRISPR基因組編輯技術方面的重要貢獻而獲得“科學突破獎”，其中一位獲獎者：Jennifer Doudna zui近在范德堡大學進行客座演講，主會場和分會場都擠滿了人，從中可以窺見這一技術的火熱程度。
CRISPR全稱為clustered regularly interspersed short palindromic repeats，是源于細菌及古細菌中的一種后天免疫系統，它可利用靶位點特異性的RNA指導Cas蛋白對靶位點序列進行修飾。直到近年，科學家們才開始利用這一系統在活體動物基因組中生成靶向突變，刪除原有的基因或插入新基因。
這一技術發展迅速，就在去年，研究人員已經發現了利用CRISPR/Cas 治愈小鼠中一種罕見肝臟疾病的方法，并且科學家們也發現可以通過這種方法切除人類免疫細胞中hiv病毒插入的基因，阻止HIV進入血液干細胞。其原因可能在于這種方法比其它基于核酸酶的編輯方法操作簡便，研究人員跟著指南操作，進行一輪PCR就能基本完成CRISPR實驗了。
但CRISPR/Cas系統也存在自身的一些缺陷，比如進入細胞后，有可能在非目標位點進行酶切，從而導致脫靶，這對于臨床應用來說是一大敗筆。
我們需要更加和有效的CRISPR工具，研究人員也正在研究如何避免這類情況的發生，開發更好的預測編輯工具，或者研發能將CRISPR元件更有效傳遞到細胞內的方式，以下是the scientist雜志匯總的新進展。
癌癥研究的啟示
研究者：康奈爾大學遺傳學教授John Schimenti
項目：利用 CRISPR/Cas9 研發癌癥和減數分裂小鼠模型
CRISPR/Cas9系統是通過在基因組上造成切口來完成編輯工作，這些切口可以通過兩種途徑修復，一種是由非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ) 過程進行粘合，這種方法有效但容易出錯;另外一種方法就是加入包含目標突變的DNA人工片段，利用同源指導修復(homology-directed repair，HDR，編者譯)完成。
Schimenti 說，“問題在于這兩個過程是競爭完成的。前者NHEJ會由于實驗小鼠出現非目標突變受到干擾，”他們希望能找到一種HDR途徑新方法完成有效，且更的編輯，
為了解決這一問題，研究人員嘗試針對過去的果蠅胚胎基因組編輯實驗改進 HDR/NHEJ 比例，他們通過遺傳手段抑制了NHEJ途徑中的一個分子：DNA連接酶IV，碰巧正好有這么一個小分子抑制劑，SCR7能抑制這種酶的作用(這種小分子在之后的實驗中被證明能作為癌癥治療分子)。
Schimenti研究組在小鼠胚胎中改變了一個基因的兩個堿基，結果證明加入SCR7能將HDR:NHEJ比率從之前的1:10調整為1:2.5，這一研究成果公布在今年的Genetics雜志上，標題為A Mouse Geneticist’s Practical Guide to CRISPR Applications。
如何操作：
只要在Cas9 和合成的DNA 被注入到你的單細胞受精卵之后，在培養基中添加 SCR7就可以了。一些其他的研究組，如范德堡大學的Douglas Mortlock也在嘗試進行這一實驗。Schimenti實驗室常會在實驗中加入這種物質，因為目前看來SCR7并不會造成什么傷害，不過“這種小分子確實會影響其它基因，所以還是需要進行對比實驗，”他說。
注意事項：
培養基中加入了SCR7(50 μ M)的受精卵生存率更高，但是在two-cell階段，SCR7 會影響細胞進入囊胚期，其原因尚不清楚。但Schimenti表示這應該不成問題，因為在那之前就可以將其轉入到雌性小鼠中了。
成本：從Xcessbio公司可以買到SCR7，價格為129 美元/2 mg(當地價格)。
人體細胞中的可誘導CRISPR
研究者：紀念斯隆凱特琳癌癥中心干細胞生物學中心的發育生物學家Danwei Huangfu
研究項目：利用人類胚胎干細胞了解胰腺發育過程中特殊基因的作用和相互影響 CRISPR/Cas工具的一大挑戰就是將這一系統中的元件傳輸到細胞內，通常這是通過電穿孔完成，但是將 CRISPR/Cas系統插入到人類干細胞中的這一過程，效率非常低，Huangfu表示，要完成一個單一突變傳送，需 要一個月的時間。
Huangfu的項目要求刪除一個或多個基因的兩個拷貝，這也就意味著多輪靶定，她需要一個效率更高的系統。
要解決這個問題，zui困難的一步是將大體積的Cas9 基因傳入到細胞內，為此Huangfu研究組構建了一種已經整 合了Cas9元件的細胞系：首先他們采用了一種相似的技術TALEN，這種技術與CRISPR技術的不同之處在于，前者采用的是DNA結合位點，后者才有的是導向RNAs(An iCRISPR platform for rapid, multiplexable, and inducible genome editing in human pluripotent stem cells)。
“通過TALENs，我們將 Cas9 整合到了人類干細胞上的一個非常特殊的位點，這一位點不易發生沉默效應。”
研究人員還設計了能在藥物多西環素存在的條件下表達 Cas9 的細胞。這種方法被稱為iCRISPR，研究人員能 利用iCRISPR在分化過程中不同時間點里打開基因組編輯。(注意不要將iCRISPR與CRISPRi弄混淆了，后者與RNAi相似，能可逆性的阻止轉錄)
iCRISPR技術能將CRISPR/Cas操作主要步驟縮減成一個：用導向RNA轉染細胞，導向RNA要小得多，也更容易進 入細胞。“我們驚訝的發現(iCRISPR)作用非常好，”Huangfu說，利用這一技術，她的研究組在一個月的時 間里完成了12個基因的突變。
如何操作：
Huangfu研究組公布了這一技術的詳細步驟(The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells)，如果已經有了一些人類干細胞基因靶向的實驗經驗，研究人員可以從Addgene 公 司購買質粒，自己構建iCas9 表達的細胞。如果材料齊全，那么一到兩個月時間就能構建出 iCas9 細胞，再用接下來的一兩個月時間完成基因組編輯細胞系。 如果不想從頭制作 iCas9 細胞，那么可以SKI Stem Cell Research Facility。
注意事項：
雖然Huangfu研究組目前還未發現明顯的脫靶效應，但是這一研究組采用了兩種措施來避免潛在的脫靶(類似 于RNAi實驗)：恢復實驗(rescue experiments，生物通譯)和用兩個不同的 CRISPRs 靶向相同基因。
成本：Addgene質粒成本為$65(當地價格)，iCas9 細胞構建需要$600，SKI購買需要400美元。
新傳送方式
研究者：哈佛大學化學與化學生物學教授David Liu
項目：在小鼠模型中尋找治療遺傳性耳聾的方法
基因組編輯蛋白需要進入靶向細胞核中完成任務，但是 CRISPR/Cas9和其它所有大分子一樣，傳遞是一個主 要問題。
而且如果 CRISPR/Cas9 系統是作為DNA質粒傳遞進入的話，Cas9 核酸酶作用會增強，不僅會切斷靶向基因， 而且還會影響其周圍的基因，導致脫靶編輯。
為了解決這一問題，Liu等人模擬了科學家們將DNA和RNA一類的核酸傳送至細胞中去的方式。這一系統依賴于 稱作為陽離子脂質的正電荷分子，其能夠結合負電荷核酸形成脂質體。脂質體一旦形成，其可通過至少兩種方 式將內容物傳遞到細胞中。在某些情況下，脂質體有可能與細胞膜融合釋放它的貨物。此外，脂質體還可能與 核內體膜融合釋放出內容物。
“我們有一個非常簡單的想法，即將研究人員用來傳送DNA和RNA的商業化陽離子脂質用于傳送蛋白質。這次我 們沒有采用超正電荷蛋白，而是利用了超負電荷蛋白，其類似于核酸處于高度的負電荷狀態。利用陽離子脂質 來傳送與高度負電荷分子結合的蛋白質，相比于采用正電荷蛋白質或肽來傳送蛋白質其效力提高了近1000 倍，”Liu說。
zui終實驗證實了利用這一新系統來傳送基因組編輯蛋白質，至少與傳送編碼基因組編輯蛋白的DNA所觀察到的 結果一樣。而且傳送蛋白比傳送DNA的基因組編輯特異性要高得多。
傳送DNA之后，在長時間內難以控制編碼蛋白的表達量。DNA傳送與期望的基因組編輯結果之間總是無法一致。在基因組編輯中，其任務是修復一個或兩個拷貝的基因。而在基因組編輯蛋白完成這一任務后，你會想讓它消 失，因為在此之后它所做的就是不希望發生并有可能是有害的事情。
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