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南京信帆生物技術(shù)有限公司
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簡(jiǎn)介：Western blot（免疫印跡實(shí)驗(yàn)）實(shí)驗(yàn)服務(wù)
提供商：南京信帆生物技術(shù)有限公司
服務(wù)名稱(chēng)：Western blot實(shí)驗(yàn)服務(wù)
| 服務(wù)名稱(chēng) | 標(biāo)本要求 | 實(shí)驗(yàn)周期 | 單位 |
| WB（普通蛋白） | 組織、蛋白、細(xì)胞 | 2周內(nèi) | 每張膜 |
Western blot簡(jiǎn)介
蛋白質(zhì)印記又稱(chēng)免疫印記，根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)樣品中的某種蛋白的方法。它是利用特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。
Western blot的原理
Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。
以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。
Western blot樣本要求
客戶(hù)需新鮮或正確保存的蛋白樣品， 檢測(cè)目的蛋白的一抗（或由本公司代購(gòu)）。樣品要求為：
1、裂解樣品總蛋白量>500ug/樣品。
2、細(xì)胞樣品總蛋白濃度>1mg/ml。
3、組織樣品總蛋白濃度>10-15mg/ml。
Western blot結(jié)果及數(shù)據(jù)提供
內(nèi)參蛋白和目的蛋白曝光膠片各一張，可提供掃描圖，實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括整個(gè)試驗(yàn)流程所涉及的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)步驟。如需進(jìn)行蛋白純化服務(wù)，將提供檢測(cè)報(bào)告
Western blot實(shí)驗(yàn)服務(wù)
服務(wù)內(nèi)容
我們提供從蛋白制備、蛋白電泳到Western blot檢測(cè)的全流程服務(wù)，如需要還可進(jìn)行灰度分析。
說(shuō)明
1、建議提供目的蛋白陽(yáng)性表達(dá)樣品（純蛋白或有陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞或組織）作為陽(yáng)性對(duì)照。
2、每張膜檢測(cè)1-8個(gè)樣品。
3、如果一抗由客戶(hù)提供，請(qǐng)?jiān)谡_條件下保存，避免污染及反復(fù)凍融。
關(guān)于Western blot實(shí)驗(yàn)異常分析
『無(wú)信號(hào)』
| 原因 | 建議 |
| 一抗與二抗不匹配 | 選擇針對(duì)一抗來(lái)源種屬制備的二抗； |
| 一抗不識(shí)別目的的種屬的蛋白 | 1)檢查抗體的說(shuō)明書(shū)，適用范圍內(nèi)是否包含目的種屬 |
| 一抗或二抗不足，沒(méi)有足夠的抗體結(jié)合到目的蛋白 | 1)降低抗體稀釋倍數(shù)，增加抗體濃度 |
| 封閉劑與一抗有交叉反應(yīng) | 改變封閉劑 |
| 抗原不足 | 1)每個(gè)泳道加入20-30ug總蛋白 |
| 在檢測(cè)的組織內(nèi)目的蛋白表達(dá)水平低 | 檢測(cè)樣本不表達(dá)目的蛋白選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，用于確定檢測(cè)樣本是否為陰性，也可更換細(xì)胞系 |
| 蛋白轉(zhuǎn)膜效率低 | 1)利用麗春紅檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效率;檢查轉(zhuǎn)移裝置是否電極弄反 |
| 膜過(guò)渡洗滌 | 減少洗滌時(shí)間和強(qiáng)度 |
| 疊氮鈉抑制二抗活性 | 二抗稀釋液內(nèi)不用疊氮鈉 |
『沒(méi)有特異條帶』
| 原因 | 建議 |
| 細(xì)胞系傳代過(guò)多后蛋白表達(dá)譜發(fā)送變化 | 1)使用未傳代或傳代次數(shù)較少的細(xì)胞系進(jìn)行樣品制備 |
| 蛋白本身有很多修飾 | 1)查閱文獻(xiàn)，確定目的蛋白是否存在多種修飾 |
| 蛋白被消化或者降解 | 1)蛋白樣品確保未被污染，確保含有蛋白酶抑制劑 |
| 所檢測(cè)蛋白存在多種剪接體，導(dǎo)致分子量大小不同 | 1)查閱文獻(xiàn)或者通過(guò)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)確定該蛋白是否存在多種長(zhǎng)度不同的編碼mRNA |
| 一抗或二抗?jié)舛雀?/span> | 1)減低抗體濃度 |
| 洗滌不夠 | 1)充分洗滌 |
『條帶大小不正確』
| 原因 | 建議 |
| 目的蛋白被降解 | 確保蛋白樣品未被污染，確保含有蛋白酶抑制劑 |
| 存在不同的剪接體 | 查閱文獻(xiàn)或者通過(guò)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)確定該蛋白是否存在多種長(zhǎng)度不同的編碼mRNA |
| 重組蛋白 | 檢測(cè)是否存在額外加入的蛋白 |
| 特殊蛋白如MDM2等 | 仔細(xì)閱讀抗體說(shuō)明書(shū) |
尊敬的客戶(hù)：
本公司有放射免疫技術(shù)服務(wù)、蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)、免疫組化、PCR技術(shù)服務(wù)、生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析等，如果您想了解Western blot的更多內(nèi)容或者其他服務(wù)信息，您可以本公司的了解更多產(chǎn)品的詳細(xì)信息，至善至美的服務(wù)是我們永無(wú)止境的追求，歡迎新老客戶(hù)放心選購(gòu)自己心儀產(chǎn)品，我們將竭誠(chéng)為您服務(wù)！
