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“恒遠生物”產品文獻：白藜蘆醇與伊馬替尼協同作用對細胞生物學行為的影響
閱讀：1139 發布時間：2019-11-8白藜蘆醇與伊馬替尼協同作用對 Ｋ５６２
細胞生物學行為的影響＊
王曉軍１ 茹甫毅１ 吳雙有１ 朱衛民１ 田培軍１
［摘要］ 目的：探討白藜蘆醇對人白血病細胞增殖的影響及機制。方法：采用不同濃度白藜蘆醇及伊馬替尼對 Ｋ５６２細胞進行干預，通過 ＭＴＴ法、臺盼藍染色觀察細胞增殖，ｃａｓｐａｓｅ－３活 性 檢 測、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染 色 及 流式細胞術觀察細胞凋亡情況和細胞增殖抑制率，利用中效原理計算出各時間段內白藜蘆醇、伊馬替尼對 Ｋ５６２細胞增殖抑制的中效濃度，以檢測二者有無聯合增效作用。結果：不同劑量白藜蘆醇、伊馬替尼單獨作用和聯合作用對 Ｋ５６２細胞均有生長抑制作用，在一定范圍內呈劑量、時間依賴性，２種藥物聯合有協同增效作用。隨著白藜蘆醇或伊馬替尼濃度升高，其ｃａｓｐａｓｅ－３活性逐漸增強。白藜蘆醇、伊馬替尼單獨作用和聯合作用對人白血病細胞 Ｋ５６２均 有 凋 亡 作 用，且聯合用藥組隨著白藜蘆醇或伊馬替尼濃度的增加，Ｋ５６２細胞的凋亡率也逐漸增 加。
結論：白藜蘆醇及伊馬替尼對白血病 Ｋ５６２細胞株均有促進凋亡作用，聯合用藥可明顯增加其凋亡率。
［關鍵詞］ 白血病；白藜蘆醇；伊馬替尼；凋亡白藜蘆醇本質是一種活性非黃酮多酚化合物的新型抗癌 劑，近年研究發現白藜蘆醇對ru腺癌、前列腺癌、皮膚癌等多種腫瘤細胞的生長均具有顯著的抑制作用，同時也對人白血病細胞具有明顯抑制生長作用，是非常有前景的天然抗腫瘤藥物。但是其抑制腫瘤細胞生長的具體機制比較復雜，文獻＊ 基金項目：陜西省衛生科研項目（Ｎｏ：Ｄ８０） １安康市中心醫院（陜西安康，７２５０００）通信作者：茹甫毅，Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｙａｎｆｏｒｅ＠１２６．ｃｏｍ報道較少。為了解白藜蘆醇在抗白血病中的作用，我們觀察了白藜蘆醇對人白血病細胞 Ｋ５６２生長的影響。現將結果報告如下。
１ 材料與方法
１．１ 材料
１．１．１ 細胞株 人白血病 Ｋ５６２細胞株購自南京科佰生物科技有限公司。
１．１．２ 細胞培養液 本實驗所用 ＲＰＭＩ－１６４０細胞培養 液 含 有 １０％ 滅 活 胎 牛 血 清，１００ Ｕ／ｍＬ 青 霉素，１００Ｕ／ｍＬ鏈霉素。· ５０７ ·臨床血液學雜志 第３０卷
１．１．３ 主要試劑 ＲＰＭＩ－１６４０細胞培養液購自美國 Ｇｉｂｃｏ公司；臺盼藍購自上海恒遠生物科技有限公司；ＭＴＴ 檢 測 試 劑 盒 購 自 Ａｍｒｅｓｃｏ公 司；白 藜蘆醇購自西安奧特斯生物制品有限公司；伊馬替尼（瑞士 ＮＯＶＡＲＴＩＳ公司）；ｃａｓｐａｓｅ－３活性檢測試劑
盒購自 Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司。
１．２ 方法
１．２．１ 實驗分組 將 Ｋ５６２細胞株分為空白對照組、伊馬替尼單藥組（０．１、０．２μｍｏｌ／Ｌ）、白藜蘆 醇單藥組（５０、１００、２００μｍｏｌ／Ｌ）、伊馬替尼聯合白 藜蘆醇 組 （伊 馬 替 尼 ０．１ μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 蘆 醇 ５０μｍｏｌ／Ｌ、伊 馬 替 尼 ０．１μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 蘆 醇 １００μｍｏｌ／Ｌ、伊 馬 替 尼 ０．１μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 蘆 醇 ２００μｍｏｌ／Ｌ、伊 馬 替 尼 ０．２ μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 蘆 醇 ５０μｍｏｌ／Ｌ、伊 馬 替 尼 ０．２μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 蘆 醇 １００μｍｏｌ／Ｌ、伊 馬 替 尼 ０．２μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 蘆 醇 ２００μｍｏｌ／Ｌ）。上述每組細胞均設置６個復孔。１．２．２ 藥品制備 白藜蘆醇及伊馬替尼片劑分別采用二甲基亞砜進行溶解，按濃度為１０ｍｇ／ｍｌ配制原液，在生理鹽水稀釋，稀釋濃度為２０μｍｏｌ／Ｌ。另外２５０ｍｇ的 ＭＴＴ 粉劑溶于５０ｍｌｐＨ 為７．４的 ＰＢＳ液 中。所 有 液 體 均 過 濾 分 裝，保 存 條 件 為－２０℃。
１．２．３ 細胞培養 將 Ｋ５６２細胞培養在含１０％胎牛血清、１００ Ｕ／ｍＬ 青 霉 素、１００ｐｇ／ｍＬ 鏈 霉 素 和２ｍｍｏｌ／Ｌ谷 氨 酰 胺 的 ＲＰＭｌ－１６４０ 培 養 液 內，于３７５％ＣＯ２ 飽 和 濕 度 條 件 下 培 養，每２～３ｄ傳代１次。細胞處于對數生長期時用于實驗。１．２．４ ＭＴＴ 法檢 測 細 胞 增 殖 收集對數生長期的 Ｋ５６２細胞于３７℃、５％ＣＯ２ 細胞培養箱中培養，分別于２４、４８、７２ｈ時加入２０μｌＭＴＴ 溶液（５ｍｇ／ｍｌ），繼續于３７℃、５％ＣＯ２ 培養箱中孵育４ｈ，隨后棄掉 細 胞 培 養 液；向 每 個 細 胞 培 養 孔 中 分 別 加 入１５０μｌＤＭＳＯ，用脫色搖床振蕩１０ｍｉｎ，隨后用酶聯免疫檢測儀，使結晶物充分溶解；選擇５７０ｎｍ 波長（Ａ５７０），以空白孔調零，于酶聯免疫檢測儀上測定各孔的吸光度并記錄結果，計算細胞增殖抑制率，公式為：細胞增殖抑制率＝１－實驗孔Ａ５７０／對照孔Ａ５７０。１．２．５ 臺盼藍拒染實驗 按照１．２．１中的分組將相應藥物加 入 至 各 組 細 胞 培 養 孔 中，作 用４８ｈ后用移液器吹打細胞使之制成單細胞懸液；將各組細胞懸液作適當稀釋后用臺盼藍進行染色，具體操作為細胞懸液與０．４％臺盼藍溶液按照９∶１比例混合均勻，隨后在３ｍｉｎ內用細胞計數板統計活細胞數和死細胞數；選擇各組作用的zui佳濃 度，分 別 用該濃度作用于 Ｋ５６２細胞，并分別于２４、４８、７２ｈ時檢測細胞的存活率。
１．２．６ 中效濃度的計算 存活率（ｆｕ）＝藥物實驗組Ａ 值／細胞對照組Ａ 值，抑制率（ｆａ）＝１－存活率（ｆｕ）。將中效方程ｆａ／ｆｕ＝（Ｄ／Ｄｍ）ｍ 兩邊取對數，得ｌｇ（ｆａ／ｆｕ）＝ｌｇ（Ｄ／Ｄｍ）ｍ＝ｍｌｇＤ－ｍｌｇＤｍ。設ａ＝－ｍｌｇＤｍ、Ｙ＝ｌｇ（ｆａ／ｕ）、Ｘ＝ｌｇＤ，則 Ｙ＝ｍＸ＋ａ。其中 Ｄ為藥物濃度，Ｄｍ 為中效濃度，即抑制率為５０％時的藥物濃度（ＩＣ５０），ｍ 為斜率，ａ為截距。
１．２．７ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染 色 實 驗 收 集 細 胞，ＰＢＳ洗，Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染 色３７℃ ３０ｍｉｎ，制 片 熒 光 顯微鏡觀察細胞核形態變化并拍照。
１．２．８ Ｃａｓｐａｓｅ－３活性 檢 測 細 胞 按ｃａｓｐａｓｅ－３試劑盒的要求處理，參考 Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司的ｃａｓｐａｓｅ－３酶活力單位的定義，即一個酶活力單位表示為當底物 處 于 飽 和 狀 態 下 時，在 ３７℃１ｈ 內 可 以 剪 切１ｎｍｏｌ Ａｃ－ＤＥＶＤ－ｐＮＡ 產 生 １ ｎｍｏｌ ｐＮＡ 的ｃａｓｐａｓｅ－３酶量，由此就可以計算出樣品中含有多少個酶活力單位的ｃａｓｐａｓｅ－３。
１．２．９ 流 式 細 胞 術（ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ雙 染 色法）檢測各組細胞凋亡情況 通過血清饑餓法對Ｋ５６２細胞行同步化處理，各組藥物作用４８ｈ后收集對數生 長 期 的 Ｋ５６２細 胞，ＰＢＳ 洗 滌 ３ 次，加 入５μｌ的 ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ和１μｌ的 ＰＩ混均，避光孵育１０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗滌１次，每管加入４００μｌ的ＰＢＳ，采用流式細胞儀檢測凋亡細胞，計算細胞凋亡率。
１．３ 統計學處理
數據 均 使 用 Ｅｘｃｅｌ表 格 進 行 錄 入，同 時 采 用ＳＰＳＳ２０．０軟 件 對 數 據 進 行 統 計 學 分 析。數 據 以ｘ珚±ｓ表示，兩樣本間的平均數比較使用獨立樣本ｔ檢驗，多 組 樣 品 間 的 均數 比 較 使 用 單 因 素 方 差 分析，檢驗水準α＝０．０５。
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