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恒遠文獻：茶多酚對體外培養鼠晶狀體抗氧化損傷作用的研究
閱讀：961 發布時間：2019-11-22茶多酚對體外培養鼠晶狀體抗氧化損傷作用的研究
李 佳，劉 丹
摘要目的:觀察茶多酚( tea polyphenols，TP) 對氧化損傷鼠晶狀體的形態學及抗氧化系統的變化，研究其對晶狀體氧化損傷的保護作用。方法:采用體外培養鼠晶狀體的氧化損傷模型，設置正常對照組、氧化損傷( H2O2 ) 組和 TP( H2O2 + TP) 組，分別于12，24，48h 后觀察各組晶狀體的混濁情況，并檢測各組晶狀體的抗氧化酶系統中的超氧化物歧化酶( SOD) 及谷胱甘肽過氧化物酶( GSH-Px) 活性以及脂質過氧化反應終產物丙二醛( MDA) 的含量。結果:正常對照組晶狀體均保持透明，未見白內障形成;H2O2組大鼠離體晶狀體隨作用時間的延長，晶狀體的混濁程度逐漸明顯增加; TP 組的晶狀體混濁較 H2O2組明顯減輕，白內障形成不明顯。晶狀體混濁相對灰度值組間比較，差異有統計學意義( P ＜ 0． 05) 。H2O2組大鼠晶狀體組織中 MDA 含量較對照組明顯增高( P ＜ 0． 05) ，而 GSH-Px和 SOD 明顯下降( P ＜ 0． 05) ，TP 組與 H2 O2 組相比，其晶狀體中MDA 降低( P ＜ 0． 05) ，但仍高于對照組，而 GSH-Px和 ATP 含量明顯升高，差異均有統計學意義( P ＜ 0． 05) 。結論:TP 可提高氧化損傷晶狀體的抗氧化能力，降低脂質過氧化物水平，從而延緩白內障的發生和發展，為臨床白內障的診療提供了新的理論基礎。
關鍵詞:茶多酚; 白內障; 氧化損傷; 過氧化氫DOI
李佳，劉丹． 茶多酚對體外培養鼠晶狀體抗氧化損傷作用的研究． 眼科雜志 2012; 12( 2) : 215-2170 引言白內障是世界上主要的致盲病因之一，同時在我國也是位列位的致盲眼病。近些年來國內外學者的研究均指出眼組織內活性氧和氧自由基的增加、抗氧化防御系統力量的削弱是白內障主要成因之一，但對晶狀體氧化損傷的途徑尚未*清楚，對白內障形成的機制尚有爭議［1，2］。因此研究白內障的發病機制，尋找能夠延緩白內障發展的藥物是防治白內障研究的熱點。目前已有很多治療白內障的藥物在使用，但其療效欠佳［3］。本研究建立體外培養鼠晶狀體氧化損傷的模型，應用抗氧化劑茶多酚( tea polyphenols，TP) 對晶狀體上皮細胞進行干預，檢測晶狀體中抗氧化酶系統的活性，從而探討 TP 對氧化損傷所致白內障的影響作用，為氧化損傷性白內障的防治尋找新的理論依據和途徑。
1 材料和方法
1． 1 材料 健康 SD 大鼠 57 只，雌雄各半，體質量 200 ～215Int Eye Sci，Vol． 12，No． 2，Feb． 2012.250g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供。茶 多 酚( 純 度99． 9% ，上海恒遠生物科技有限公司) ，300mL /L 過氧化氫溶液( 南昌市東湖青山試劑助劑廠) 分析純，復方托吡卡胺滴眼液( 參天制藥株式會社) ，超氧化物歧化酶( SOD)測試盒( 南京建成生物工程研究所) ，谷胱甘肽過氧化物酶( GSH-Px) 測試盒( 南京建成生物工程研究所) ，脂質過氧化反應終產物丙二醛( MDA) 測試盒( 南京建成生物工程研究所) ，眼科顯微手術器械( 蘇州器械六廠) ，超凈工作臺( 蘇州凈化設備廠) ，倒置顯微鏡( IX70 型，日本 Olympus公司) ，CO2細胞培養箱( Forma Scientific，3164) ，裂隙燈顯微鏡( 蘇州儀器六廠) ，掃描電鏡( HITACHI，S-570) ，可見分光光度計( 上海菁華科技儀器有限公司，752N) 。
1． 2 方法
1． 2． 1 標本的處理 復方托吡卡胺滴眼液散瞳后于裂隙燈顯微鏡下檢查晶狀體的透明性，全部實驗大鼠晶狀體均透明。將大鼠頸椎脫臼處死后，鉗取完整眼球，9g /L 生理鹽水沖洗，再用 750mL /L 乙醇沖洗數秒后，用含 320kU/L慶大霉素的 PBS 溶液和含 800kU/L 青霉素、1 000kU/L 鏈霉素的 PBS 溶液各沖洗 10min。在手術顯微鏡下從后極部剪開鞏膜取出晶狀體( 保留部分覆蓋在晶狀體表面的玻璃體) ，放入含 5kU/L 青霉素、50kU/L 鏈霉素的 MEM培養基中預培養，以供實驗用。
1． 2． 2 實驗分組 將篩選出的 114 個晶狀體隨機分 3 組，其中正常對照組 14 個，氧化損傷( H2O2 ) 組和 TP 組各 50個，每組 12，24，48h 隨機選取 4 個晶狀體，分組如下: ( 1)正常對照組: MEM 培養液 30mL，內含 100mL /L 小牛血清、5kU/L 青霉素、50kU/L 鏈霉素; ( 2) H2 O2 組: 除對照組培養液外，另加 300mL /L H2 O2 1． 02μL( H2 O2 終 濃 度 為300μmol /L) ; ( 3) TP 組: 除 H2O2組各成分外，另加 TP 5mL( TP 濃 度 為 0． 2mg /L) 。于 37℃，50mL /L CO2，濕 度 為95% 的培養箱中孵育。除對照組外，其它各組均應在第6，12，18h 分別加入 300mL /L H2O2 0． 8μL，以調節培養液中 H2 O2 濃度達到 300μmol /L。分別在加入培養液后于12，24，48h 停止孵育，取標本進行檢測。
1． 2． 3 掃描電鏡觀察 每組培養 48h 后各取 2 個晶狀體，立即置入 25mL /L 戊二醛溶液中固定，0 ～ 4℃ 冰箱內保存，72h 后取出，在赤道部切取 1mm2柱狀晶狀體結構( 帶有囊膜) 作為透射電鏡的樣本，用 0． 1mol /L 磷酸鹽液沖洗，1% 鋨酸固定 2h，乙醇梯度脫水，環氧樹脂滲透包埋，鈾鉛重金屬染色，掃描電鏡觀察并照相。
1． 2． 4 晶狀體相對灰度值的觀察 分別將被檢晶狀體于12，24，48h 在光學顯微鏡下觀察，在 24 孔板下襯以白底黑色“井”狀背景拍照，并觀察晶狀體混濁程度，將照片掃描入電腦，并用 Micrografx Picture Publisher 軟件分析圖像中黑色“井”字的每個交叉點的灰度和鄰近交叉點的白色背景的灰度，兩者之差即為相對灰度值。
1． 2． 5 抗氧化酶活性的測定
1． 2． 5． 1 晶狀體谷胱甘肽過氧化物酶的測定 分別于培養 12，24，48h 取出大鼠晶狀體，用 0 ～ 4℃ PBS 充分沖洗，再用濾紙吸干后稱質量，置入含 5mL 0 ～ 4℃ PBS 的勻漿器內，冰浴下充分研磨 5min 制成勻漿，低溫高速離心機10 000r/min 離心 15min，取上清液，羥胺法測定 GSH-Px 含量: 蛋白勻漿液 0． 02mL，10mmol /L pH7． 16 磷酸鹽緩沖液1． 43mL，10mmol /L 2，4-二硝基氯苯( CDNB) 0． 05mL，50U/mL谷胱甘肽巰基( GST) 0． 02mL; 標準管加 3． 11mmol /L 還原型谷胱甘肽( GSH) 0． 02mL，于 340nm 處測其光密度。
1． 2． 5． 2 丙二醛的測定 分別于培養 12，24，48h 取出大鼠晶狀體，用 0 ～ 4℃ PBS 充分沖洗，再用濾紙吸干后稱質量，以 1g 組織加入 9mL 11． 5g /L 氯hua鉀液為標準進行勻漿。在不同試管中依次加入不同晶狀體勻漿液 0． 2mL，80g /L 十二烷基硫酸鈉 0． 2mL，200mL /L 醋酸 1． 5mL 及8g /L 硫代巴 比 妥 酸 1． 5mL，用 雙 蒸 餾 水 調 節 終 體 積 至4mL。95℃水浴加熱 60min。取出冷卻后，加入 3． 5mL 正丁醇與吡啶的混合液( 兩液體體積比為 15∶ 1) ，振搖后提取有機層，以四乙氧基丙烷為標準，在熒光分光光度計上測定熒光強度，激發光波長 515nm，發射光波長 553nm，計算 MDA 的量。
1． 2． 5． 3 晶狀體超氧化物歧化酶的測定 分別于培養 12，24，48h 取出大鼠晶狀體，用0 ～ 4℃ PBS 充分沖洗，再用濾紙吸干后稱質量，用旋渦混勻器充分混勻，置 37℃ 恒溫水浴 40min，將各管混勻，室溫放置 10min，于波長 550nm 處，1cm 光徑比色杯，蒸餾水調零，比色測各管 OD 值。統計學分析: 數據用均數 ± 標準差( x珋± s) 表示，采用SPSS 10． 0 統計軟件對數據進行分析，采用單因素方差分析和多樣本比較的秩和檢驗，以 P ＜ 0． 05 作為差異有統計學意義。
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