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“恒遠(yuǎn)生物”產(chǎn)品文獻(xiàn):蛇床子素支架材料修復(fù)兔下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

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BMSCs/PRF復(fù)合載蛇床子素支架材料修復(fù)兔下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究
郭延偉 李松 房殿吉*
(佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科 黑龍江  佳木斯    154000)

 

[摘要] 目的:探討 BMSCs/PRF 復(fù)合載蛇床子素支架材料修復(fù)兔下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究的可行性。方法:36 只新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組,每組12只,雙側(cè)下頜骨制備缺損模型。A 組植入 BMSCs/PRF 復(fù)合載蛇床子素支架材料;B 組植入 BMSCs復(fù)合載蛇床子素支架材料,C 組單植入納米羥基磷灰石支架材料。分別于術(shù)后2、4、8、12 周處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,制備組織標(biāo)本,行大體觀察、影像學(xué)分析、HE 染色、掃描電鏡檢測(cè),并對(duì)影像學(xué)分析值及成骨情況加以評(píng)價(jià),對(duì)分析數(shù)據(jù)結(jié)果使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,P <0.05 有統(tǒng)計(jì)意義。結(jié)果:影像學(xué)檢查及組織學(xué)染

色顯示 A 組骨缺損處愈合程度,成骨速度及其質(zhì)量明顯優(yōu)于 B組C 組;掃描電鏡顯示 A 組該復(fù)合材料與組織相容
性好,無炎癥刺激反應(yīng);統(tǒng)計(jì)牙 CT 分析數(shù)據(jù)及新生骨面積,A 組的成骨情況明顯優(yōu)于B 組與C 組(P <0.05)。結(jié)論:BMSCs/PRF 復(fù)合載蛇床子素支架材料有明顯骨誘導(dǎo)作用,是一種新型復(fù)合材料,可望成為臨床應(yīng)用中修復(fù)頜骨缺損的新型材料。
[關(guān)鍵詞] 骨  頜骨缺損  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 BMSCs   富血小板纖維蛋白 PRF   蛇床子素 Osthol
[中圖分類號(hào)] R782.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1671—7651(2012)11—1087—05
ResearchofBMSCs/PRFCompoundwiththeOstholScaffoldsforRepairtheMandibularDefectsoftheRabbit.GUO Yan-wei,LISong,FANG Dian-ji.DepartmentofOraland MaxillofacialSurgery,HospitalofStomato- logical,JiamusiUniversity,Jiamusi154004
[Abstract]  Objective:ToinvestigatethefeasibilityoftheBMSCs/PRFcompound withtheOstholscaffoldsfor
repairthemandibulardefectsoftherabbit.Methods:36 New Zealand whiterabbitswererandomlydividedinto3 groups.Bilateralmandibulardefectmodelwasprepared.A:groupofimplanted MSCs/PRFcompositescaffolds Osthol;B:groupimplantedBMSCscompositescaffoldscontainingOsthol,C:groupofsinglenano-hydroxyapa- titescaffoldsimplanted.Allexperimentalanimalsweresacrificedafter2,4,8,12 weekstopreparetissuesamples. Theobservationingeneralandradiographicanalysiswerecarriedout.HEdyeing,SEM detecting,andanalysisof thevalueoftheImagingandthebonewereperformed.Results:Invivoimagingandhistologicalstainingshowed thatbonedefectbonequalityofagroupwassignificantlybetterthanthoseofothergroups.SEM showedthewell compositematerialandtissuecompatibility,noinflammationreaction;BymeasuringandanalyzedthedentalCTda- taandnewbonearea,theAgroupbonewasobviouslybetterthantheothergroups (P <0.05).Conclusion:The BMSCs/PRFcompoundwiththeOstholscaffoldsforrepairthemandibulardefectsoftherabbithasobviousinduc- tionofbone.Itisanewcompositematerial,expectedtobecometheclinicalapplicationofnew materialstorepair themandibulardefects.
[Keywords]  Bone   MandibularDefects  BMSCs  Platelet-richfibrin(PRF)  Osthol

下頜骨功能結(jié)構(gòu)復(fù)雜,而造成其缺損的原因也很多,若不及時(shí)進(jìn)行修復(fù)或修復(fù)不當(dāng),則常常會(huì)造成骨不連或延遲愈合等嚴(yán)重后果。隨著當(dāng)代組織工程學(xué)及分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展,利用干細(xì)胞作為種子細(xì)胞復(fù)合支架材料修復(fù)骨缺損成為近年來研究的熱
基金項(xiàng)目  國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):81170935)
作者簡(jiǎn)介   郭延偉(1985~  ),男,山東聊城人,碩士,主要從事口腔頜面外科的研究工作。
* 通訊作者  房殿吉,dian話:0454-8625581
點(diǎn),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM- MSCs)以其多項(xiàng)分化的潛能及自身所具有的遺傳背景穩(wěn)定和對(duì)機(jī)體無免
疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為理想的種子細(xì)胞[1~3]。PRF是繼富血小板血漿(platelet-richplasma,PRP)后第2代血小板濃縮液,以血小板凝膠形式呈現(xiàn),其所
內(nèi)含的高濃度的生長(zhǎng)因子能促進(jìn)骨組織和軟組織再生修復(fù),單獨(dú)或聯(lián)合其他生物材料注人硬組織缺損或軟組織創(chuàng)傷處,可以修補(bǔ)缺損,誘導(dǎo)生長(zhǎng),加速局部創(chuàng)傷的愈合并提高愈合質(zhì)量[4~6]。實(shí)驗(yàn)證明,蛇


床子素 可 促 進(jìn) 大 鼠 骨 髓 間 充 質(zhì) 干 細(xì) 胞 (BM - MSCs)的增殖及向成骨細(xì)胞分化并抑制其向脂肪細(xì)胞分化,而且蛇床子素具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的
能力[7,8]。本研究將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞,以載蛇床子素的羥基磷灰石為支架材料,結(jié)合
PRF 中多種生長(zhǎng)因子及其誘導(dǎo)并促進(jìn)成骨修復(fù)兔下頜骨缺損,為臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1   實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  健康新西蘭大白兔36 只,體重2.
0~3.0kg,3~6月齡,雌雄不限,(由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),材料及儀器:醫(yī)用納米級(jí)羥基磷
灰石(上海源葉生物科技有限公司),蛇床子素(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司),離心機(jī),JSM -6360LV掃描電鏡,倒置相差顯微鏡,牙 CT。
1.1.1   骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取及培養(yǎng)   無菌條
件下,骨髓穿刺針兔雙側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子處抽取骨髓3
~5 mL,然后加入 20 mL 的 DMEM 培養(yǎng)液中混勻,過濾雜質(zhì)后以1500r/min 離心20 min,離心完后取上層骨髓,加入5 mL 制成 DMEM 培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)為10 個(gè)/mL),然后置入容積為 30 mL 的培養(yǎng)瓶中,加入10mL 含20%新生小牛血清、青霉 素 100 U/mL、硫 酸鏈霉素 100g/mL 的 DMEM 培養(yǎng)液,再次離心1200r/min離心10 min,去上清,計(jì)數(shù)。然后置入37 ℃、5%CO2  培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24h貼壁,呈梭形成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng),72h后大量細(xì)胞成纖維樣生長(zhǎng),部分區(qū)域成漩渦樣細(xì)胞群,見圖1。在細(xì)胞種植的第4 天第1 次換液,以后每2d換液1 次,細(xì)胞生長(zhǎng)7~10d 后長(zhǎng)滿瓶底面積的80%時(shí)2.5%胰蛋白酶收集計(jì)數(shù)并傳代。

圖1   BM-MSCs倒置顯微鏡(×200) 圖2   PRF 膜狀結(jié)構(gòu)
Fig.1  Invertedmicroscope Fig.2   StructureofPRFfilm ofBM-MSCs
1.1.2   富血小板纖維蛋白(PRF)制備   自兔耳緣靜脈抽取血液8 mL 收集到不添加抗凝劑的無菌試管中迅速離心,1200r/min 離心10 min,即分為3層,中間層即為PRF,用無菌紗布擠壓 PRF,使其成為膜狀結(jié)構(gòu),眼科剪剪成碎片植入普通培養(yǎng)液備用,
見圖2。
1.1.3   載蛇床子素-NA 支架材料模型的制備
蛇床子素與羥基磷灰石按1∶1 比例置入直徑:1.0 cm,厚:0.3cm 模具中,成 型穩(wěn)定,稱 重 (21±1) mg,制備24顆,待用。
1.1.4   細(xì)胞載體復(fù)合物的制備   培養(yǎng)第3 代 BM- SCs制成細(xì)胞懸液濃度2×10 個(gè)/mL 接種于載蛇床子素與 NA 支架材料(1∶1)上,然后培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,更好的使BMSCs進(jìn)入支架材料孔隙中。

圖3 A、B、C3組 X 線4周
Fig.3   X-rayofA,B,Cgroupsafter4w
圖4   A、B、C3組 X 線 12周
Fig.4   X-rayofA,B,Cgroupsafter12w
1.2   手術(shù)分組及試驗(yàn)方法
1.2.1   手術(shù)分組  36 只新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組,每組12只,制備雙側(cè)下頜骨缺損模型,A 組植入 BMSCs/PRF 復(fù)合載蛇床子素支架材料;B 組植入 BMSCs復(fù)合載蛇床子素支架材料,C 組單植入羥支架材料。
1.2.2   試驗(yàn)方法  取兔稱重后,20%烏拉坦(5 ml/ kg)耳緣靜脈注射麻醉。麻醉顯效后常規(guī)術(shù)區(qū)備皮消毒鋪巾后沿左側(cè)下頜骨下緣做平行切口,長(zhǎng)度3
~4cm,分層切開皮膚皮下組織,暴露下頜骨下緣及頰面,而后用裂鉆于下頜骨體頰側(cè)中下處制備骨
缺損,直徑1.2cm,深度0.3cm。按手術(shù)分組植入不同材料。手術(shù)中生理鹽水降溫,右側(cè)同上。充填完畢,分層嚴(yán)密縫合切口,分籠飼養(yǎng)。術(shù)后肌注慶大
霉素預(yù)防感染,劑量為2萬 U/次,2次/d,持續(xù)5d。
1.3   觀察指標(biāo)
1.3.1   大體觀察  觀察骨缺損區(qū)表面情況及新骨形成情況及探測(cè)骨表面硬度。
1.3.2   影像學(xué)分析  X 線觀察骨缺損區(qū)密度影的改變及材料與周圍組織接觸情況。牙 CT 掃描骨缺損區(qū)內(nèi)6個(gè)不同位點(diǎn),并記錄 CT 值,取均值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
1.3.3   組織學(xué)觀察   于骨缺損區(qū)周圍0.5 mm 處取材,4%多聚甲醛固定24h后脫鈣處理,常規(guī)標(biāo)本


浸蠟,包埋,切片,HE 染色,光鏡觀察。
1.3.4   掃描電鏡觀察 將組織塊置于4% 戊二醛固定液24h取出,PBS液沖洗3次,梯度乙醇脫水,醋酸異鎢酯中置換15 min,JSM-6360LV 掃描電鏡檢測(cè)材料與周圍組織密合情況及生物相容性。
1.3.5   計(jì)算機(jī)圖像分析   術(shù)后4 個(gè)時(shí)間段所有組織連續(xù)切片,并進(jìn)行系統(tǒng)選片,每塊組織選5 張,光鏡100倍下每張切片系統(tǒng)隨機(jī)選取6 個(gè)視野,在圖像分析儀下進(jìn)行組織學(xué)形態(tài)分析,測(cè)定術(shù)后各個(gè)時(shí)
間點(diǎn)上新生骨小梁面積所占修復(fù)區(qū)面積的比值。
表1 各時(shí)間段3組骨缺損區(qū) CT 值測(cè)定比較分析
Table1    ComparativeanalysisoftheCT values measuredfortwo
±s 表示,組間、組內(nèi)差異比較采用t 檢驗(yàn)分析,P <
0.05 為差異有顯著性意義,見表1、表2。
表2 各時(shí)間段兩組新生骨占骨缺損面積的百分比
Table2   Thepercentageofthenewboneareaoftotalbonedefects
x珚±s
組別       2周         4周         8周         12周
A 組  39.50±2.52 43.25±1.71 51.50±1.30 62.25±3.76 B組   22.00±2.3430.15 ±3.5141.00 ±3.3147.45±2.13 C組   13.00±1.83 25.00±2.16 31.25±1.26 36.50±3.42
注:與對(duì)照組比較,P<0.05
2 結(jié) 果
2.1   大體觀察  2 周時(shí),A 組材料小部分吸收,界
bonedefects
x珚±s
清,其余兩組缺損區(qū)有纖維狀組織包裹,C 組多見炎
性滲出,3組探測(cè)質(zhì)地均較軟;4周時(shí),A 組材料吸收明顯,缺損邊緣與周邊骨結(jié)合較牢固,探測(cè)質(zhì)地較
B組   -332±27.79-121±11.62 22±10.31   115±13.23
    C組   -402±22.37-182±26.99 -18±8.04   48±12.68 
注:與對(duì)照組比較,P<0.05
1.3.6   統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用 SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)
CT  值及新生骨小梁面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以 x珚
硬,B 組,C 組纖維組織充填較多,質(zhì)地軟;8 周時(shí),A組材料大部吸收,缺損區(qū)與周圍骨無明顯差異,硬度明顯增加,B 組殘存材料較多,硬度不及實(shí)驗(yàn)組;12
周時(shí),A 組缺損區(qū)骨膜包被,硬度與周圍骨相當(dāng),B
組,C 組表面仍有纖維組織,硬度不明顯。







圖5   A 組掃描電鏡12周 圖6   B組12周 圖7   C組12周
Fig.5   SEM ofAgroupafter12w Fig.6   SEM ofBgroupafter12w Fig.7   SEM ofCgroupafter12w

圖8   A 組蘇木精- 伊紅染色(×200)12周 圖9   B組蘇木精- 伊紅染色(×200)12周 圖10   C組蘇木精- 伊紅染色(×200)12周
Fig.8   HEstainingofAgroupafter12w Fig.9   HEstainingofBgroupafter8w Fig.10   HEstainingofCgroupafter12w

2.2  X 線檢測(cè)  2 周時(shí),3 組缺損區(qū)內(nèi)低密度影明顯,有材料阻射影,與周圍骨組織界清;4 周時(shí),A 組可見絮狀高密度影,材料可見吸收,硬度增加,與周
圍正常骨邊界尚清,B、C 組缺損區(qū)材料阻射影依舊
清楚,低密度影多,與周圍界限清;8 周時(shí),A 組區(qū)域可見均勻骨痂影像,有骨性連接,骨密度增加,與周圍界限不清,B 組缺損區(qū)可見絮狀高密度影,骨密度
較低,與周圍界限尚清,C 組低密度影明顯

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