亞硫酸鐵瓊脂特殊培養(yǎng)法

二倍體細(xì)胞培養(yǎng)法與一般培養(yǎng)相同，關(guān)鍵在于傳代，其傳代程序?yàn)椋?/span>

1.吸除舊培養(yǎng)液注入另瓶中。

2.用溫BSS沖洗1次。

3.用0.25%溫*消化，加入消化液量以僅覆蓋細(xì)胞層即可；作用1~5分鐘。

4.待細(xì)胞附著松動(dòng)、細(xì)胞質(zhì)邊緣卷起和間隔加大，便終止消化。為防止細(xì)胞丟失,可不必再用BSS沖洗,直接向瓶中加入培養(yǎng)液（新舊培養(yǎng)液按2：1新舊混合）。

5.輕輕反復(fù)吹打制成單個(gè)細(xì)胞懸液。

6.按一分為二比例接種培養(yǎng)。

使用飼細(xì)胞(Feeder Cells)。制備方法：

1.取原代培養(yǎng)的人或動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞，90%匯合時(shí)制成細(xì)胞懸液，再按105細(xì)胞/毫升重新接種培養(yǎng)。

2.在細(xì)胞半?yún)R合時(shí)，準(zhǔn)備0.25μg/ml的絲裂霉素C，按2μg/106細(xì)胞的量加入到培養(yǎng)瓶中過夜；或用射線單次照射，劑量30～50戈瑞。

3.細(xì)胞經(jīng)上述處理后，Hanks液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng)24小時(shí)，*消化細(xì)胞制成懸液，按5×104（104細(xì)胞/cm2）接種入新亞硫酸鐵瓊脂中。

4.48小時(shí)后，即可用于細(xì)胞克隆之用。

細(xì)胞分離（克隆）培養(yǎng)

多孔塑料培養(yǎng)板單細(xì)胞克隆法：

1.消化：取健康待克隆細(xì)胞，吸出瓶內(nèi)培養(yǎng)液，加消化液。

2.低密度細(xì)胞懸液的制備：做克隆細(xì)胞時(shí)首先需先用消化法制備出分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，然后稀釋細(xì)胞，使之成為1~2細(xì)胞/毫升懸液，zui適宜細(xì)胞密度為1~2細(xì)胞/ml培養(yǎng)液。

3.接種：先用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，使混懸均勻，繼用加樣器向塑料培養(yǎng)板每孔內(nèi)加0.5毫升。接種時(shí)要迅速準(zhǔn)確，爭(zhēng)取在zui短時(shí)間內(nèi)加完，以免培養(yǎng)液蒸發(fā)，然后迅速蓋好蓋板，置CO2溫箱培養(yǎng)。

4.標(biāo)記：培養(yǎng)6~12小時(shí)后，待細(xì)胞下沉冰貼附于培養(yǎng)板孔底后，從溫箱中取出，置倒置光顯微鏡臺(tái)上，觀察和標(biāo)記下含有單個(gè)細(xì)胞的孔，置CO2溫箱培養(yǎng)。在培養(yǎng)中一般無需換液，只有在細(xì)胞增長過于緩慢時(shí)才可進(jìn)行換液。換液時(shí)先吸除舊培養(yǎng)基，但不要吸除過多，余少許，以免細(xì)胞干涸。然后再迅速補(bǔ)加新鮮克隆培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3~4周。待孔內(nèi)細(xì)胞增至500~600個(gè)時(shí)，可進(jìn)行分離培養(yǎng)。

5.分離擴(kuò)大培養(yǎng)：培養(yǎng)86~96小時(shí)后進(jìn)行觀察。挑選生長良好的單細(xì)胞克隆孔，先吸除舊培養(yǎng)液，用Hanks洗1~2次，繼加*少許，加入量已能覆蓋細(xì)胞群即可，如過多，應(yīng)吸除多余消化液。置于倒置顯微鏡下窺視，待發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓時(shí)，加入0.1ml含10%血清的克隆培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，當(dāng)細(xì)胞離開底物懸浮后，一并吸入管內(nèi)，移入另瓶或皿中，再補(bǔ)加一定量克隆培養(yǎng)液，置CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)、增殖，使之形成新的細(xì)胞群后，即轉(zhuǎn)用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)。

相關(guān)產(chǎn)品如下：

hz-724    小鼠紅白血病細(xì)胞
hz-725    兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞
hz-726    小鼠垂體瘤細(xì)胞(分泌促生長激素分泌激素)
hz-727    小鼠骨髓瘤細(xì)胞
hz-728    兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞
hz-729    兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞
hz-730    大鼠垂體瘤細(xì)胞
hz-731    小鼠原B細(xì)胞株
hz-732    小鼠腦瘤細(xì)胞
hz-733    大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞
hz-734    豬腎細(xì)胞
hz-735    小鼠胚胎成纖維細(xì)胞
hz-736    小鼠成纖維細(xì)胞
hz-737    小鼠樹突狀細(xì)胞肉瘤細(xì)胞
hz-738    大鼠肝細(xì)胞
hz-739    新生牛眼晶體上皮細(xì)胞
hz-740    新生牛眼Tenon's囊成纖維細(xì)胞
hz-741    兔角膜后基質(zhì)層成纖維細(xì)胞
hz-742    兔角膜前基質(zhì)層成纖維細(xì)胞
hz-743    大鼠氣管上皮細(xì)胞
hz-744    兔眼Tenon's囊成纖維細(xì)胞
hz-745    小鼠乳腺癌細(xì)胞
hz-746腎上皮細(xì)胞
hz-747    大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞
hz-748    小鼠肺腺癌細(xì)胞系
hz-749    鼬肺上皮細(xì)胞
hz-750    兔晶體上皮細(xì)胞永生系
hz-751    大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞
hz-752    小鼠B淋巴細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞
hz-753    小鼠B淋巴細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞
hz-754    倉鼠/小鼠雜交瘤細(xì)胞