PCR技術(shù)具有高度的特異性、選擇性、靈敏性，而且快速、簡便、易于自動(dòng)化，因此在臨床醫(yī)學(xué)工作中受到廣泛的重視及合理的應(yīng)用。目前在我國許多基層醫(yī)療單位均已相繼開展PCR研究用應(yīng)用工作。PCR技術(shù)很簡單，原理也很清楚，因此有條件的單位都能較順利地上馬，但畢竟PCR技術(shù)是一種新生事物，受到許多條件因素的影響，所以要做得好也不容易。在pcr技術(shù)應(yīng)用過程中會(huì)遇到這樣或那樣的問題，更甚至?xí)玫脚c事實(shí)完成相反的結(jié)果。為了使我們能夠順利地開展PCR工作，更好地發(fā)揮PCR技術(shù)的工具作用，我們根據(jù)多年來PCR工作總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)，對PCR擴(kuò)增過程中經(jīng)常出現(xiàn)的一些問題進(jìn)行簡要的總結(jié)，提供給廣大科研工作者作為參考，拋磚引玉，不足之處歡迎指正。
　　
　　一、假陽性擴(kuò)增
　　
　　在實(shí)驗(yàn)過程中有時(shí)會(huì)碰到所檢驗(yàn)的樣本全部陽性，而且擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶亮度均一，這是擴(kuò)增系統(tǒng)受到污染時(shí)zui典型的一種表現(xiàn)，需仔細(xì)檢查，排除污染源，一般應(yīng)從以下步驟著手：
　　
　　⒈試劑污染：
　　
　　廠方提供的試劑或其中的某種組分在出廠或運(yùn)輸、貯存過程中受到污染。檢測方法，可按試劑盒說明書將試劑分裝好，直接置于PCR儀中擴(kuò)增（不加陰性對照，可加適量蒸餾水），便可簡單而有效地判斷試劑是否已受到污染。
　　
　　⒉實(shí)驗(yàn)室污染：
　　
　　這是zui常見的污染源，由于PCR技術(shù)可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)將模板中某些特異性序列擴(kuò)增到數(shù)百萬倍以上，擴(kuò)弗產(chǎn)物可能在電泳等過程中污染移液器、操作臺或隨著蒸發(fā)所形成氣溶膠而污染整個(gè)實(shí)驗(yàn)室。擴(kuò)增產(chǎn)物又是zui有效的模板，一旦出現(xiàn)產(chǎn)物污染其污染程度都較嚴(yán)重。判斷方法：可以將實(shí)驗(yàn)中zui關(guān)鍵步驟如試劑分裝、樣品處理等轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的環(huán)境中或轉(zhuǎn)移到超凈工作臺中完成。當(dāng)然，所用的移液器、吸咀管（離心管）都應(yīng)*更換。解決方法：實(shí)驗(yàn)室污染是pcr擴(kuò)增過程中zui易出現(xiàn)的現(xiàn)象，而且一旦出現(xiàn)污染，消除污染源又極其困難，往往需對整個(gè)實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)器材*清洗處理，所以應(yīng)該以預(yù)防為主，實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)基本要求，樣品處理與擴(kuò)增產(chǎn)物及電泳應(yīng)盡量分開，能在兩個(gè)房間進(jìn)行。擴(kuò)增前處理所用的移液器及擴(kuò)增后點(diǎn)樣用的移液器應(yīng)嚴(yán)格地分開，不可互換。PCR室應(yīng)保持良好的通風(fēng)、清潔、能。
　　
　　⒊采樣污染：
　　
　　在實(shí)驗(yàn)過程中，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)一批結(jié)果陽性率很高，一批結(jié)果陽性率又下降很多，如此反復(fù)，這種現(xiàn)象大都是由于采樣時(shí)污染所致，一般來講正規(guī)試劑生產(chǎn)廠家，其試劑出廠時(shí)都要經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測、批間，特別是批內(nèi)差異都極小，不致出現(xiàn)如此明顯的反復(fù)，這種現(xiàn)象主要是由于收集樣本的試管或吸管受到污染所致。PCR擴(kuò)增非常敏感，而一般實(shí)驗(yàn)室對重復(fù)使用的試管所進(jìn)行的洗滌方法往注不能去除痕量DNA，這些痕量DNA便成為PCR模板，出現(xiàn)陽性擴(kuò)增結(jié)果，由于采樣試管受污染程度不一，所以出現(xiàn)忽高忽低的現(xiàn)象解決方法建議使用一次試管及吸咀取樣。
　　
　　二、假陰性擴(kuò)增：
　　
　　如果連續(xù)幾次擴(kuò)增結(jié)果都是陰性，或已知陽性樣本出現(xiàn)陰性擴(kuò)增結(jié)果，一般認(rèn)為這是假陰性，出現(xiàn)這現(xiàn)象有以下幾種原因：
　　
　　⒈儀器故障：
　　
　　出現(xiàn)全陰結(jié)果，首先考慮到儀器運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常。正確判斷儀器的工作狀況，是排除假陰性其它原因的基礎(chǔ)，儀器運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常是PCR擴(kuò)增zui關(guān)鍵的步聚之一。判斷儀器是否正常，首先要測定加熱體的溫度是否準(zhǔn)確，波動(dòng)范圍是否答合要求，各孔之間差異是否符合要求，PCR擴(kuò)增往往對儀器加熱溫度及各管間的差異要求有很高的精度，如果誤差太大，勢必出現(xiàn)假陰性。必須注意的是不能過信，我們經(jīng)常發(fā)現(xiàn)一些機(jī)器溫度差異高達(dá)二度以上。
　　
　　⒉試劑失效或無效：
　　
　　了解機(jī)器是否正常，便可對試劑進(jìn)行檢測。首先要了解試劑是否超過有效期，試存放方法是否達(dá)到要求，如果試劑盒在有效期內(nèi)，貯存方法是正確，那么就應(yīng)該仔細(xì)、慎重地判斷試劑是否是無效試劑或稱不合格試劑。可以用已知陽性樣本，或試劑盒提供的陽性對照，嚴(yán)格按說明書操作擴(kuò)增一次，然后把擴(kuò)增產(chǎn)物用雙蒸水稀釋1000倍，作為模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增，判斷結(jié)果，如果是陰性說明試劑無效或不合格，如果結(jié)果陽性那么可用以下方法判定試劑的靈敏度。