1 實時熒光定量pcr技術的方法學

1.1 原理 所謂real-time Q-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，zui后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在 real-time 技術的發展過程中，兩個重要的發現起著關鍵的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發現，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產物成為可能。（2）此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉 的反應管中能實時地監測反應全過程。這兩個發現的結合以及相應的儀器和試劑的商品化發展導致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運用。

pcr反應過程中產生的DNA拷貝數是呈指數方式增加的，隨著反應循環數的增加，zui終PCR反應不再以指數方式生成模板，從而進入平臺期。在傳統的PCR 中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應的zui終擴增產物，因此用此終點法對PCR產物定量存在不可靠之處。在real-time Q-PCR中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監測和連續地分析擴增相關的熒光信號，隨著反應時間的進行，監測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲 線。在PCR反應早期，產生熒光的水平不能與背景明顯地區別，而后熒光的產生進入指數期、線性期和zui終的平臺期，因此可以在PCR反應處于指數期的某一點 上來檢測PCR產物的量，并且由此來推斷模板zui初的含量。為了便于對所檢測樣本進行比較，在real-time Q-PCR反應的指數期，首先需設定一定熒光信號的域值，一般這個域值（threshold）是以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號 （baseline），熒光域值的缺省設置是3～15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認為是真正的信號，它可用于定義 樣本的域值循環數（Ct）。Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的 對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣 品的起始拷貝數。

1.2 熒光化學 目前real-time Q-PCR所使用的熒光化學方法主要有五種，分別是：DNA結合染色，水解探針，分子信標，熒光標記引物，雜交探針。它們又可分為擴增序列特異和非特異的檢測兩大類。

擴增序列非特異性檢測方法的基礎是DNA結合的熒光分子，如SYBR green 1等熒光染料。Real-time Q-PCR發展早期就是運用這種zui簡單的方法，在PCR反應體系中，加入過量SYBR green 1熒光染料，SYBR green 1熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號。熒光染料的優勢在于它能監測任何dsDNA序列的擴增，不需要探針的設計，使檢測方法變得簡便，同時 也降低了檢測的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結合，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結合，使實驗容易產生假陽性信號。引 物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線（melting curve）分析的軟件加以解決。

擴增序列特異性檢測方法是在PCR反應中利用標記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產物，它又可分為直接法和間接法。間接的方法就是利用水解探針的策 略。目前在real-time Q-PCR中zui廣泛使用的TaqMan系統就是運用了這個原理。pcr擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分 別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團，此時5′端熒光基團吸收能量后將能量轉移給臨近的3′端熒光淬滅基團（發生熒光共振能量轉移，FRET），因 此探針完整時，檢測不到該探針5′端熒光基團發出的熒光。但在PCR擴增中，溶液中的模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結合。在引物的介導下， 沿模板向前延伸至探針結合處，發生鏈的置換，Taq酶的5′-3′外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）將探針5′端連接的熒光基 團從探針上切割下來，游離于反應體系中，從而脫離3′端熒光淬滅基團的屏蔽，接受光刺激發出熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現 了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。