一、重組DNA技術相關概念
(一)DNA克隆

克隆(clone)：來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。

克隆化(cloning)：獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。

1.分子克隆(DNA克隆)

2.細胞克隆

3.個體克隆(動物或植物)

DNA克隆：

應用酶學的方法，在體外將各種來源的DNA與載體DNA結合成具有自我復制能力的DNA分子，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一DNA分子。又稱基因克隆或重組DNA。

基因工程：

實現基因克隆所采用的方法及相關的工作，又稱為重組DNA技術 (recom-binant DNA technology)。

(二)工具酶

1.限制性核酸內切酶(restriction endonuclease)

識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。是細菌內存在的保護性酶。分為I、II、III三類。II類酶識別序列特點為回文結構。

限制性核酸內切酶作用后產生兩種末端：鈍性末端(blunt end)粘性末端(sticky end)

限制性核酸內切酶識別序列長度為4~8個bp。不同酶切產生的相同粘性末端稱配伍末端(compatible end)，可用連接酶連接。

2.DNA聚合酶I

3.逆轉錄酶

4.DNA連接酶

5.堿性磷酸酶

6.末端轉移酶

7.Taq DNA聚合酶

(三)目的基因

應用重組DNA技術所要分離、獲得的基因。

1.cDNA(complementary DNA):是指經反轉錄合成的，與RNA互補的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板，經聚合反應可合成雙鏈cDNA。

2.基因組DNA(genomic DNA)：是指代表一個細胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。

(四)基因載體(vector)

能攜帶目的基因，實現無性繁殖所采用的可獨立復制的完整DNA分子。又稱克隆載體。其中為表達出蛋白質設計的載體又稱表達載體。

常用的載體：質粒、噬菌體DNA、病毒DNA載體的選擇標準： 能自主復制;

具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定;

有克隆位點(外源DNA插入點)，常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點;

分子量小，以容納較大的外源DNA。

1.質粒(plasmid)是存在于細菌染色體外的小型環狀雙鏈DNA分子。大小約為數 千堿基對。常有 1 ~ 3個抗藥性 基因，以利于篩 選。

2.噬菌體(phage)DNA

λ 噬菌體DNA改造系統

λ gt 系列(插入型，適用cDNA克隆)

EMBL系列(置換型，適用基因組克隆)

M13噬菌體DNA改造系統(含lac Z基因)

M13mp系列

pUC系列

3.其他

柯斯質粒(cosmid)

酵母人工染色體載體(yeast artificial chromosome,YAC)

細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome,BAC)

動物病毒DNA改造的載體(如腺病毒、腺病毒相關病毒、逆轉錄病毒)

二、重組DNA技術基本原理

(一)目的基因的獲取

1.化學合成法:用于已知序列，或可推導出序列的基因

2.基因組DNA

基因組DNA文庫(genomic DNA library):存在于轉化細菌內，由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。簡稱G-文庫。

3.cDNA:

cDNA文庫(cDNA library)用細胞總mRNA 制備全套雙鏈cDNA后，建立的基因文庫。簡稱 c-文庫。

4.聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)

PCR是根據DNA復制的原理，在體外利用酶促反應獲得特異序列的基因組DNA或cDNA的專門技術。

PCR的反應體系：模板DNA、特異性引物、DNA聚合酶、dNTP及含有Mg2++的緩沖液。

PCR的基本反應步驟：

1.變性：將反應系統加熱至95℃ ，使模板DNA*變性成為單鏈;

2.退火：將溫度下降至50℃左右，使引物與模板DNA退火結合;

3.延伸：將溫度升至72℃ ，DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA的合成反應。

上述三個步驟為一個循環，經25～30次循環后，可將模板DNA擴增達百萬倍。

(二)克隆載體的選擇

(三)外源基因與載體的連接

1.粘性末端連接

2.平端連接

限制性內切酶作用產生的平端粘端經特殊酶處理變為平端

3.同聚物加尾連接

由末端轉移酶作用，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端再連接。

4.人工接頭

由平端加上帶有新的酶切位點的寡核苷酸，再用限制酶切產生粘性末端，進行連接。

(四)重組DNA導入受體菌

受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態

導入方式：轉化

轉染(transfaction)

感染(infection)

(五)重組體的篩選

重組DNA導入受體菌后，經過培養使其大量繁殖，再設法將含有目的基因的菌落區分鑒定出來，這一過程即為篩選(screening)或選擇(selection)。

1.直接選擇法：針對載體攜帶某種或某些標志基因和目的基因而設計的篩選方法。其特點是直接測定基因或基因表型。

抗藥性標記選擇(插入失活法)：將目的基因插入帶ampr和tetr基因載體的tetr基因中，則tetr基因失活。在分別含有氨芐青霉素和含四環素的兩個培養基中培養，進行篩選。

標志補救(marker rescue)

若目的基因能夠在宿主菌表達，且表達 產物與宿主菌的營養缺陷互補，就可利用對營養素的依賴表型來篩選。

分子雜交法：利用32P標記的探針與轉移至硝酸纖維素膜上的轉化子DNA或克隆的DNA片段進行分子雜交，直接選擇并鑒定目的基因。

原位雜交

Southern印跡

2.非直接選擇法：

免疫學方法：利用特異抗體與目的基因表達產物相互作用進行篩選。包括：

免疫化學方法

酶免檢測法

(六)克隆基因的表達

表達體系的建立：

表達載體的構建

受體細胞的建立

表達產物的分離、純化

1.　原核表達體系

E.coli的標準：

選擇標志

強啟動子

翻譯調控序列

多接頭克隆位點

E.coli的不足：

缺乏轉錄后加工機制

缺乏翻譯后加工機制

表達產物形成不溶性包涵體

很難表達大量可溶性蛋白

2.　真核表達體系

如酵母、昆蟲及哺乳類動物細胞

優點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當修飾表達的蛋白質表達產物分區積累

缺點：操作技術難、費時、不經濟

轉染：將表達載體導入真核細胞的過程

三、重組DNA技術與醫學的關系

疾病基因的發現

發展生物制藥

DNA診斷

基因治療

遺傳疾病的預防