1 目的：DNA擴增標準化操作規(guī)范適用于HLA試驗中的DNA擴增操作。
2 適用范圍：DNA基因分型實驗室。
3 依據(jù)：DNA擴增標準化操作規(guī)范
4 引用文件：德國BAG公司（以下簡稱BAG） 《Instructions for use Instructions for use HISTO TYPE/DNA-ABDR 384》
5 程序
5．1 試劑準備
5.1.1 BAG® 384 試劑包,包括擴增板、Buffer、讀板紙、說明書
5.1.2 滅菌蒸餾水
5.1.3 taq酶
5.2 儀器及用具準備
5.2.1 移液器規(guī)格：1-10ul , 20-200ul , 200-1000ul
5.2.2 電動連續(xù)加樣器
5.2.3 移液器配套吸頭，要求滅菌
5.2.4 離心管：1.5ml，要求滅菌
5.2.5 水平式離心機
5.2.6 配套384板的DNA擴增儀
5.2.7 石臘油、平皿
5.2.8 中性記號筆
5.2.9 手套，規(guī)格：乳膠手套，與操作者手形相適應，經滅菌
5.3操作步驟：
5.3.1 換工作服、戴手套
5.3.1.1 從工作服衣柜中換取工作服，戴上適應自己手形的乳膠手套。
5.3.2 擴增混合液的配置
5.3.2.1 選擇DNA
濃度要求大于20ng/ul, A260/A280要求在1.60 至2.0之間的DNA方可
每4個DNA樣品為一組。
5.3.2.2 核對DNA抽提記錄，確認需要擴增的DNA號碼正確無誤
5.3.2.3 計算每個混合液的組成：
Buffer：106ul
DNA量原則：要求每個樣本有5-8ugDNA，一般原則如下：
DNA濃度（ng/ul） DNA量(ul)
10 — 40 200
40 — 80 102
80以上 70
酶每個樣本DNA要求35U, 酶量計算公式：酶量= 35/ 酶活性單位/ul
H2O量計算：H2O量=1060-酶量-buffer-DNA量
混合液總體控制在1060ul左右
記錄以上配制信息
5.3.2.4 取1.5ml 離心管，按照配制記錄上DNA順序放置DNA 和空離心管，使兩者一一對應，用記號筆標記DNA號到對應的空離心管上
5.3.2.5 檢查確認空離心管上的DNA號碼準確無誤
5.3.2.6 按照配制記錄 ，以（1）Buffer（2）H2O（3）Taq酶（4）DNA 的順序依次將各反應成分加入離心管中，要防止交叉污染。注意（1）（2）（3）三種成份，每加入一種成份換一次槍頭，DNA模板每加一管換一次槍頭。蓋上離心管的蓋，混勻。
5.3.2 加樣擴增
5.3.2.1 從-20℃的冰箱中拿出384干板放于室溫一段時間，待干板回到室溫后，用油性記號筆在6列和7列、12列和13列、18列和19列之間各畫一條記號線 進行樣品間的劃分。調節(jié)連續(xù)加樣器，使每次加樣的量為10ul,可以連續(xù)加樣10—50次。從每個樣品的左上*孔連續(xù)加入10ul。注意加樣的槍頭不要與底部的引物接觸，以避免帶入其他孔的引物而影響實驗結果。因此，加樣時，應加在靠近孔口處，讓液體自然流下。
5.3.2.2 加樣完成后，使用粘性耐熱膜封嚴384干板。先打開耐熱膜的一端，對應的貼在384干板的一端，然后沿貼的一端，一邊打開耐熱膜，一邊緊緊的貼在板上，zui終整塊粘性耐熱膜*牢牢粘貼在384干板上。用記號筆在板上正確記錄樣品號，保證無誤后，2000rpm離心5分鐘。如果不是馬上擴增，可以加樣后暫不離心，放入冰箱保存，待擴增時再離心，但時間不宜過長。
5.3.2.3 擴增前，取出干板，放到PCR頭上，保證孔對孔；加蓋膠墊，擰緊PCR頭的蓋子上的旋鈕，以操作者感到旋鈕吃緊即可。設定的擴增程序即可擴增。
5.3.2.4 約100分鐘后，擴增完成。打開PCR儀熱蓋，取下384板，放入冷藏冰箱或立即電泳。
5.3.2.5 關上PCR儀。