問(wèn)：SMARTTM cDNA 技術(shù)的原理是什么？
答： SMARTTM cDNA 合成技術(shù)利用總RNA 或者Poly A+ RNA 作為模板，以一種改造的oligo(dT)寡苷酸作為引物，在MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶催化作用下合成*鏈。當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶到達(dá)mRNA 的5"末端時(shí)，反轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性會(huì)在*鏈 cDNA 的3"端加上3-5 個(gè)脫氧胞苷酸。SMART寡苷酸的3"端含有一段延長(zhǎng)的鳥(niǎo)苷酸殘基，與富集的胞苷酸退火形成延伸的模板。然后反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)換模板，以SMART 寡苷酸作為模板繼續(xù)延伸。這樣合成得到的單鏈cDNA 在3"端有一段與SMART 寡苷酸互補(bǔ)的序列，在5"端有一段與oligo(dT)引物互補(bǔ)的序列。這些序列作為下一步進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR 的引物合成位點(diǎn)。結(jié)果可以得到富集全長(zhǎng)序列的雙鏈cDNA。

問(wèn)：SMART試劑盒系列產(chǎn)品之間有什么差別？
答： SMART cDNA Library Construction Kit 是用來(lái)從少量RNA 樣本中構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA 文庫(kù)。試劑盒中包括有SMART cDNA 合成和文庫(kù)構(gòu)建到? TriplEx2 或者Creator 供體載體pDNR-LIB所需的試劑。因?yàn)樵撛噭┖惺翘貏e針對(duì)文庫(kù)構(gòu)建來(lái)設(shè)計(jì)的，所以它與Clontech™ PCR-Select™cDNA 差減雜交試劑盒不能配合使用。
SMArt pcr cDNA Synthesis Kit 可以用來(lái)與Clontech™ PCR-Select™ cDNA 差減技術(shù)一起使用。總RNA 不能直接用來(lái)做差減實(shí)驗(yàn)，但可以通過(guò)SMART PCR cDNA Synthesis Kit 來(lái)擴(kuò)增出高質(zhì)量的cDNA，從而可以用作雜交實(shí)驗(yàn)。同樣，少量的Poly A+ RNA 也可以用SMART PCR cDNA Synthesis Kit 來(lái)擴(kuò)增。SMART cDNA 也可以在你僅有有限的RNA 樣本時(shí)從來(lái)做虛擬的Northern 雜交，用來(lái)代替標(biāo)準(zhǔn)的Northern 雜交。SMART PCR cDNA Synthesis Kit 含有SMARTⅡ寡苷酸和cDNA 合成引物，兩段序列都具有用來(lái)做Clontech™ PCR-Select 差減所需的RsaⅠ位點(diǎn)。該試劑盒也可以從來(lái)構(gòu)建SMART cDNA 文庫(kù)于其它自選載體中。
SMART RAce cDNA Amplification Kit 結(jié)合了SMART cDNA 合成技術(shù)和RACE 的方法。該試劑盒優(yōu)點(diǎn)在于可以構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA,無(wú)需接頭連接，靈敏度強(qiáng)，方法簡(jiǎn)單。

問(wèn)：SMART技術(shù)可以用來(lái)做cDNA 末端快速擴(kuò)增嗎（RACE）?
答：可以。隨著新的SMART RACE cDNA Amplification Kit 的進(jìn)一步完善，SMART 技術(shù)的所有優(yōu)點(diǎn)都可以用在RACE 方案中。

問(wèn)：為什么在SMART cDNA Synthesis 過(guò)程中對(duì)PCR 循環(huán)數(shù)有一定限制？
答：SMART cDNA 技術(shù)的*點(diǎn)之一就是長(zhǎng)距離PCR 擴(kuò)增步驟。為了保持SMART cDNA 的基因代表性，進(jìn)行盡量少的循環(huán)數(shù)量是很必要的。如果循環(huán)數(shù)過(guò)高，擴(kuò)增超過(guò)指數(shù)增長(zhǎng)階段時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)ssDNA 的積累，不適合進(jìn)行cDNA 后期操作如克隆或者差減。此外，循環(huán)數(shù)越高，熱穩(wěn)定聚合酶出錯(cuò)的幾率就越高，PCR 的保真度相應(yīng)就會(huì)降低。因此，為了獲得高質(zhì)量的cDNA，穩(wěn)定循環(huán)數(shù)在認(rèn)可的參數(shù)之內(nèi)是非常重要的。

問(wèn)：SMARTTM文庫(kù)的特點(diǎn)有哪些？
答：SMART cDNA 文庫(kù)富集了全長(zhǎng)的cDNA。插入片段的平均大小是1.5-2 Kb。我們?cè)?jīng)從SMART 文庫(kù)中克隆到的zui大插入片段是大于6kb 的β-肌球蛋白cDNA。即使起初材料用的是總RNA，也幾乎不會(huì)篩選到核糖體RNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，來(lái)自于SMART cDNA 文庫(kù)的50 個(gè)克隆分析表明沒(méi)有核糖體RNA 克隆。以50 ng 總RNA 或者25 ng poly A+ RNA 構(gòu)建的SMART cDNA 文庫(kù)的基因保真度，與用標(biāo)準(zhǔn)的Gubler and Hoffman 方法以5 ug poly A+ RNA 構(gòu)建的文庫(kù)相似。

問(wèn)：為什么SMARTTM PCR 擴(kuò)增得到的cDNA 沒(méi)有rRNA 序列？
答：雖然在SMART *鏈cDNA 合成過(guò)程中rRNA 可以被反轉(zhuǎn)錄，但這些序列在接下來(lái)的PCR過(guò)程中不會(huì)被擴(kuò)增。這是因?yàn)槎鄶?shù)情況下，rRNA 序列是通過(guò)自身引導(dǎo)來(lái)反轉(zhuǎn)錄的，所以zui終得到的cDNA 片段不具備5"和3"SMART 特異性序列，不能夠進(jìn)行指數(shù)PCR 擴(kuò)增。

問(wèn)：可以用作SMART PCR cDNA 擴(kuò)增模板所需的RNA 的zui少量是多少？
答：雖然我們用SMART 技術(shù)可以從10ng 的總RNA 中構(gòu)建文庫(kù)，但我們推薦原始材料zui少是50ng 總RNA 或者25ng poly A + RNA。從而保證SMART cDNA 群質(zhì)量更高，基因代表性更強(qiáng)。

問(wèn)：我可以改變SMARTTM寡苷酸序列嗎？
答：任何一種寡苷酸序列的改變都會(huì)影響cDNA 合成和擴(kuò)增的效率。SMARTⅡ和SMART Ⅳ寡
苷酸的序列和設(shè)計(jì)都是受保護(hù)的。