1 northern雜交

northern雜交是檢測mirna表達(dá)的一種簡便而可靠方法，不僅用于檢測mirna在組織細(xì)胞中的表達(dá)水平，而且結(jié)合rna marker，可經(jīng)凝膠電泳檢測mirna的分子大小。

1993年始，northern雜交應(yīng)用于miRNA表達(dá)譜研究，也是*用于半定量檢測mirna的實驗技術(shù)，通過將已知濃度梯度的寡核苷酸參照物與待測樣品進行平行雜交，實現(xiàn)對mirna的半定量檢測。而后，northern雜交成為檢測細(xì)胞中mirna表達(dá)的常規(guī)研究方法之一。 northern雜交zui大的缺點是對樣品的需求量較高，需要微克級樣品才能避免假陰性，有時樣品量達(dá)到40 μg才會出現(xiàn)明顯雜交信號。

2 原位雜交

原位雜交分為細(xì)胞和組織內(nèi)原位雜交，該技術(shù)檢測mirna表達(dá)，可更直觀的展示出mirna的時空表達(dá)模式。80年代后期可在福爾馬林固定、石蠟包埋的組織中進行原位雜交，近年來擴展到細(xì)胞及亞細(xì)胞水平進行mirna的檢測。該技術(shù)不僅可以檢測不同細(xì)胞系單個細(xì)胞中的mirna表達(dá)，還可在不經(jīng)分類和分離的情況下，比較不同細(xì)胞系中mirna的表達(dá)水平。

3 基因芯片

基因芯片技術(shù)可以高通量的檢測基因表達(dá)譜。zui初的mirna基因芯片，是將反義dna探針點在尼龍膜上，然后以5′端放射性標(biāo)記的mirna樣品雜交，再經(jīng)放射自顯影獲得信號。

盡管基因芯片技術(shù)敏感度有了很大提高，且可用于多個mirna同時檢測，但仍有不足：基因芯片的制作和檢測需要昂貴的儀器設(shè)備;結(jié)果是半定量的，重復(fù)性較差;不能同時優(yōu)化所有待測mirna的雜交環(huán)境，因而不能區(qū)分高度類似的mirna，等等。鎖定的核苷酸修飾探針(locked nucleic acidmodified probe)在基因芯片技術(shù)的應(yīng)用，可能會進一步較地區(qū)分高同源性mirna的表達(dá)差異。

4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，rtpcr)

4.1 半定量rtpcr

rtpcr作為半定量或定量檢測mirna表達(dá)的常用實驗方法，在研究mirna表達(dá)的過程中不斷得到改進。半定量rtpcr是常用的一種簡潔、快速、特異的相對定量的rna檢測技術(shù)，只能測定mirna的相對含量，后來有研究對半定量rtpcr加以改進:(1)rna加尾rtpcr：rna加尾rtpcr是在傳統(tǒng)rtpcr的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，可用于半定量或定量檢測mirna的表達(dá),結(jié)果與northern雜交一致。該技術(shù)有以下優(yōu)點：可在較短時間內(nèi)獲得結(jié)果;高通量，可同時檢測多種mirna的表達(dá);與northern雜交相比，僅需少量rna，且不用放射性同位素標(biāo)記;可同時檢測到成熟mirna及其對應(yīng)的premirna;操作過程簡單。該技術(shù)檢測mirna表達(dá)時需注意以下問題：有的mirna和其他mirna具有同源區(qū)域，它們的引物序列就是mirna基因序列5′端的一部分，因而要確保引物3′端的不同;退火溫度是保證高度特異擴增的關(guān)鍵因素，有研究提出，較高的退火溫度(60 ℃～61 ℃)可提高反應(yīng)的特異性;與用總rna相比，使用從低分子量rna中富集的mirna可提高該技術(shù)的敏感性。(2)引物延伸rtpcr：引物延伸rtpcr既可檢測成熟的mirna，也可檢測單個mirna和sirna。后經(jīng)改進把引物延伸用于實時rtpcr 定量檢測mirna的表達(dá)，包括以下步驟：用加尾的特異引物把mirna反轉(zhuǎn)錄為cdna，在cdna的一端引入1個結(jié)合位點延長長度;實時定量pcr檢測。

4.2 實時定量rtpcr

實時定量rtpcr可用于檢測mirna在腫瘤中的表達(dá)水平。

steploop實時定量rtpcr是一項高特異度、敏感度的檢測mirna表達(dá)的實驗技術(shù)，包括設(shè)計具有莖環(huán)(stemloop)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物和用mirna熒光標(biāo)記的特異分子探針進行實時pcr 2個關(guān)鍵步驟。該技術(shù)有以下優(yōu)點：高度特異性，特異的steploop 反轉(zhuǎn)錄引物和探針確保反應(yīng)不受其前體及基因組dna污染等因素的干擾，對序列高度同源的mirna也可區(qū)分;超寬的定量線性范圍和高度的檢測靈敏度，從幾個拷貝到幾萬個拷貝，定量線性范圍跨越7個數(shù)量級;樣品消耗少，僅需1～10 ng的總rna;適用范圍廣，總rna 、細(xì)胞裂解物以及純化的rna都可用于mirna的定量檢測，也可用于其他小分子rna的檢測，如sirna。但是該技術(shù)需要較昂貴的實驗材料及儀器。