單位定義

限制性?xún)?nèi)切酶的一個(gè)活性單位是指，在50μl 的反應(yīng)體系里，采用隨酶提供的 NEBuffer，用1個(gè)小時(shí)的時(shí)間，*消化1μg底物DNA所需要的酶量。 酶切反應(yīng)應(yīng)在帶蓋的eppendorf 管中進(jìn)行，選用技術(shù)數(shù)據(jù)卡上所標(biāo)明的適宜溫度。在確定酶活性之前，濃縮的酶應(yīng)該用推薦的貯存液稀釋成大約1,000 單位/ml。

質(zhì)量控制

所有質(zhì)量控制鑒定結(jié)果都公布在隨酶提供的技術(shù)數(shù)據(jù)卡上。

非特異性?xún)?nèi)切酶鑒定

為鑒定非特異性?xún)?nèi)切酶污染，限制性?xún)?nèi)切酶與缺少該酶識(shí)別序列的超螺旋DNA底物溫育。對(duì)于RF I型DNA(超螺旋形式)，一個(gè)單一的非特異性缺口就會(huì)將它轉(zhuǎn)變成RF II型DNA(帶缺口環(huán)狀)。小份的限制性?xún)?nèi)切酶與1μgDNA在50μl反應(yīng)體系中，采用推薦的NEBuffer，在推薦的溫度下溫育4小時(shí)。兩種形式的DNA在瓊脂糖凝膠上很容易區(qū)分，可以計(jì)算出從RF I 到 RF II的轉(zhuǎn)化率。

核酸酶污染的過(guò)夜鑒定

所有的限制性?xún)?nèi)切酶與1μg 底物DNA在50μl反應(yīng)體系中，采用推薦的NEBuffer溫育過(guò)夜。比較酶切1小時(shí)的特征帶型和過(guò)夜酶切的帶型。如果兩種情況下帶型均明顯、沒(méi)有改變，則說(shuō)明測(cè)試的酶中不存在非特異性的dna酶。我們報(bào)道了可以溫育過(guò)夜的zui大酶單位數(shù)。

核酸外切酶污染鑒定

所有的限制性?xún)?nèi)切酶與1μg 單雙鏈混合的、3H標(biāo)記的E.coli DNA (200,000 cpm/μg)在50μl反應(yīng)體系中，采用隨酶提供的NEBuffer，在推薦的溫度下溫育4小時(shí)。通過(guò)可溶解的TCA著色，可以計(jì)算出反應(yīng)體系中被標(biāo)記的DAN的百分比，進(jìn)而可以顯示出核酸外切酶的污染。該種方法可檢測(cè)出的底線(xiàn)是0.05%。

DNA片段的連接

DNA片段通過(guò)用每一種限制性?xún)?nèi)切酶過(guò)量消化底物DNA而獲得。這些片段隨后用T4 DNA連接酶連接( 5′ 末端濃度為0.1-1.0 μM)。連接的片段然后用同一種限制性?xún)?nèi)切酶重切。僅當(dāng)3′ 和 5′末端都保留完整，連接反應(yīng)才會(huì)發(fā)生;而且只有那些識(shí)別位點(diǎn)*恢復(fù)的分子才能被重切。切割后正常的帶型說(shuō)明3′ 和 5′末端都是完整的，而且準(zhǔn)備的酶樣品中檢測(cè)不到核酸外切酶和磷酸酶。采用PstI的一個(gè)例子顯示如下：

限制性?xún)?nèi)切酶的質(zhì)量控制鑒定
藍(lán)白斑篩選鑒定

用于克隆的酶還須通過(guò)額外的質(zhì)量鑒定――藍(lán)白斑篩選鑒定，以確定經(jīng)酶過(guò)量消化后DNA末端的完整性。該種鑒定方法為：用酶10倍過(guò)量消化適當(dāng)?shù)妮d體上lacZ基因中單一的酶切位點(diǎn)，連接，轉(zhuǎn)化，并涂XGal/IPTG/Amp平板。成功地切割、連接和表達(dá)b-galactosidase可以說(shuō)明克隆后基因是完整的，一個(gè)完整的基因產(chǎn)生藍(lán)斑，一個(gè)不完整的基因(例如，降解的DNA末端)產(chǎn)生白斑。在進(jìn)行藍(lán)白斑鑒定中，所有的限制性?xún)?nèi)切酶產(chǎn)生的白斑數(shù)量不應(yīng)超過(guò)3%。