通常所用的PCR方法都在兩個(gè)方面有局限，即目標(biāo)產(chǎn)物程度和合成片段的大小。Pfu(Pyrococcus furiosus)dna聚合酶，具有完整的3’外切酶校讀活性（3’-editing-exonuclease），可以將每個(gè)循環(huán)中堿基的錯(cuò)配率由10*-4降到10*-3，從而提高PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。但它在擴(kuò)增1.5-2.0kb片段時(shí)，效率比Klentaq l(Taq DNA聚酶N-末端缺失突變體，類似于E.coli DNA聚合酶Ｉ Klenow片段）或AmpliTaq（全長(zhǎng)的Taq DNA聚合酶）等聚合酶差；在擴(kuò)增5.0-7.0kb片段時(shí)亦不比各種形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq 1、Klentaq 5等N-末端缺失的變異株）有明顯*之處。因而以往的PCR反應(yīng)產(chǎn)物限制在5.0kb以內(nèi)。超出這一范圍，PCR擴(kuò)增反應(yīng)效率將明顯下降，同時(shí)產(chǎn)物會(huì)降解。即使將延伸時(shí)間定為30分鐘（10倍于通常所需）亦無改進(jìn)。

利用兩種DNA聚合酶進(jìn)行較大片段DNA的擴(kuò)增

　　美國(guó)華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Barnes WM等對(duì)前述問題進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究，認(rèn)為：pcr反應(yīng)效率低zui主要的原因是由于錯(cuò)配的堿基阻礙了延伸反應(yīng)的正常進(jìn)行，Pfu DNA聚合酶雖然可以通過“校讀”功能糾正錯(cuò)配的堿基，但亦可能降解引物，尤其是在較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間下；酶濃度較高時(shí)，反應(yīng)效果更差。因此必需將Pfu DNA聚合酶的濃度控制在較低狀態(tài)，同時(shí)配合使用Klentaq l等DNA聚合酶，這樣既可以有效地去除錯(cuò)配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反應(yīng)順暢進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，按15:1 的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶，引物大小為27-33nt,即可使反應(yīng)有效進(jìn)行。當(dāng)然，對(duì)于各種不同條件的反應(yīng)，兩種類型酶的zui配比需要具體考慮。

控制脫嘌呤反應(yīng)增強(qiáng)擴(kuò)增效率

　　在PCR反應(yīng)體系中某些成分耐熱性較差，會(huì)影響反應(yīng)效率。DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性一般都是較好的，可能是模板DNA在溫度較高的環(huán)境中某些位點(diǎn)發(fā)生脫嘌呤反應(yīng)從而阻礙反應(yīng)的順利進(jìn)行。Lindahl和Nyberg的研究結(jié)果顯示：在70℃ pH7.4的條件下， 單鏈DNA脫嘌 呤反應(yīng)的速度是雙鏈DNA的４倍；100℃ pH7.0時(shí)，100kb的堿基中每分鐘將有１個(gè)位點(diǎn)脫嘌呤。這一反應(yīng)與緩沖體系中酸堿度的變化有關(guān)。人們注意到：三羥甲基氨基甲烷（Tris）的酸解離常數(shù)（pKa）會(huì)隨溫度升高而改變，平均每升高１℃，pKa值降低0.03。因而，在25℃時(shí)pH8.55的PCR反應(yīng)體系，到95℃熱變性時(shí)，pH值將變?yōu)?/span>6.45，這就很可能誘導(dǎo)脫嘌呤反應(yīng)。 為了解決這一問題，可以采取下列措施：

　　縮短熱變性時(shí)間，Barnes等在擴(kuò)增35kb的大片段時(shí)，變性條件為95℃5秒，取得滿意結(jié)果；
　　盡可能使升溫、 降溫過程縮短，可選擇使用導(dǎo)熱性能*的薄壁反應(yīng)管及較為*的擴(kuò)增設(shè)備；
　　適當(dāng)提高反應(yīng)體系的pH值，反應(yīng)zui初應(yīng)控制在pH8.8-9.2范圍；
　　適當(dāng)增加延伸時(shí)間（可長(zhǎng)至20分鐘）。使用這種方法可以擴(kuò)增zui大為35kb的dna片段，產(chǎn)物的準(zhǔn)確性亦有充分保證，克服了以往基因克隆過程中出現(xiàn)的DNA分子內(nèi)的堿基重排和可能的毒性危險(xiǎn)等問題。