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上海士鋒生物科技有限公司
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士鋒生物植物組織中DNA的提取與測定

時間:2014-3-6閱讀:812
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一、原理

脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)是一切生物細胞的重要組成成分,主要存在于細胞核中,鹽溶法是提取DNA的常規技術之一。從細胞中分離得到的DNA是與蛋白質結合的DNA,其中還含有大量RNA,即核糖核蛋白。如何有效地將這兩種核蛋白分開是技術的關鍵。DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液中,而RNA則能溶于0.14mol/L 的NaCl溶液之中,利用這一性質就可以將二者從破碎細胞漿液中分開。制備過程中,細胞破碎的同時就有Dnase釋放到提取液中,使DNA因被降解而影響得率,在提取緩沖液中加入適量的檸檬酸鹽和EDTA,既可抑制酶的活性又可使蛋白質變性而與核酸分離,再加入陰離子去垢劑0.15%的SDS,經過2h攪拌,或用氯仿-異醇除去蛋白,通過離心使蛋白質沉淀而除去,得到的是含有核酸的上清液。然后用95%的預冷乙醇即可把DNA從除去蛋白質的提取液中沉淀出來。 

二、材料、儀器設備及試劑: 

(一)材料:去胚乳的小麥芽,新鮮花椰菜等。 
(二)儀器設備:1. UV-120分光光度計;2. 磨口三角瓶;3. 具塞刻度試管;4. 研缽等器皿。 

試劑:
1. 研磨緩沖液:稱取59.63gNaCl,13.25g檸檬酸三鈉,37.2gEDTA-Na分別溶解后合并為一,用0.2mol/L 的NaOH調至pH7.0,并定容至1000ml。
2. 10×SSC溶液:稱取87.66gNaCl和44.12g檸檬酸三鈉,分別溶解,一起定容至1000ml。
3. 1×SSC溶液:用10×SSC溶液稀釋10倍。
4. 0.1×SSC溶液:用1×SSC溶液稀釋10倍。
5. rnase溶液:用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml 的酶液,用1mol/L HCl,pH至5.0,使用前經80℃水浴處理5min(以破壞可能存在的Dnase)。
6. 氯仿-異戊醇:按24ml氯仿和1ml異戊醇混合。
7. 5mol/L 高氯酸鈉溶液:稱取NaClO4.H2O7 0.23g,先加入少量蒸餾水溶解再容至100ml。
8. SDS(十二烷基硫酸鈉)化學試劑的重結晶:將SDS放入*中達到飽和為止,然后在70~80℃的水浴中溶解,趁熱過濾,冷卻之后即將濾液放入冰箱,待結晶出現再置室溫下涼干待用
9. 1mol/L HCl。

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