1、引物最好在模板 cDNA 的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)
DNA 序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件比對(duì)，各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。
2、引物長度一般在15~30堿基之間
引物長度(primer length)常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。
3、引物 GC 含量在 40%~60% 之間，Tm值最好接近 72℃
上下游引物的 Tm 值是寡核苷酸的解鏈溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于 Tm 值 5~10℃，其 Tm 值最好接近 72℃ 以使復(fù)性條件最佳。
4、引物 3′ 端要避開密碼子的第 3 位
如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物 3′ 端不要終止于密碼子的第 3 位，因密碼子的第 3 位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。
5、引物 3′ 端不能選擇 A，最好選擇 T
當(dāng)末位鏈為 T 時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C 錯(cuò)配的引發(fā)效率介于 A、T 之間，所以 3′ 端最好選擇 T 。
6、堿基要隨機(jī)分布
降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列
引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)使引物本身復(fù)性。
8、引物的 5′ 端可以修飾，而 3′ 端不可修飾
引物 5′ 端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物su、熒光、di高辛、Eu3+等，引物的延伸是從 3′ 端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。
9、擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)
某些引物無效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。
10、引物應(yīng)具有特異性
引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行 BLAST 檢測(cè)。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。
