簡介：這種DNA損傷分析試劑盒用于測定損傷的8.2kb大鼠體內和體外的線粒體DNA，在QPCR分析后用實時PCR定量復制的DNA。該試劑盒可對多達20個樣本進行重復分析（40個反應）。

艾美捷大鼠實時定量PCR DNA損傷分析試劑盒#DD2R組分：

? 2X濃縮QPCR緩沖液（450µL）

? QPCR引物混合物【正向引物和反向引物各2μM】（225μL）

? QPCR檢測DNA[50納克/μL]（10μL）

? 5X增強劑（180μL）

? 8.2 kb實時標準[1ng/uL]（25μL）

? 實時引物混合物【正向引物和反向引物各5μM】（100μL）

不包括在套件中：

? SYBR Green Mix（可單獨購買）

? 不含核酸酶的水

? PCR管和蓋

DNA損傷分析試劑盒相關程序分析：

1.QPCR熱循環儀程序

? 此配置文件的預編程PCR機器：

a.98°C，30秒

b.98°C，10秒

c.63°c，10秒

d.72°C，4分鐘

e.30個循環（步驟b至d）。

f.72°C，10分鐘

g.4°C

程序：以下程序適用于每20μL的反應。增加所有金額

根據管道總數成比例。

? 每個PCR管（20μL Rx），混合以下物質：

a.10.0μL 2X QPCR濃縮緩沖液

b.4.0μL 5倍增強劑

c.5.0μL QPCR引物混合物（每個引物2μM，正向/反向）

d.1.0μL DNA（50納克/μL）

*等分反應前的渦流儲備緩沖液

2.實時PCR程序（用于20μL實時PCR反應）

? 建議將來自QPCR的PCR DNA產物稀釋10倍

在進行實時PCR步驟之前用不含核酸酶的水。

? 混合以下物質：

o 10μL SYBR綠色混合物（不包括在試劑盒中）

o 7.1μL H2O（無核酸酶）

o 0.9μL實時引物混合物（每個引物5μM）

o 2.0μL DNA樣本（來自上述QPCR的PCR產物）

? 對于8.2kb的標準曲線，以下優化的DNA濃度為

推薦：

o 2納克/2μL H2O**

o 200 pg/2μL H2O

o 20 pg/2μL H2O

o 2 pg/2μL H2O

o 0.2 pg/2μL H2O

o 0.02 pg/2μL H2O

o 0頁/2m1小時20分

**8.2kb實時標準

推薦的實時PCR程序

a） 50攝氏度2分鐘

b） 95攝氏度10分鐘

（程序40個c和d循環）

c） 95攝氏度15秒

d） 60攝氏度60秒

計算：

使用閾值循環值（CT）和DNA創建標準曲線

8.2kb標準品中每一個的濃度（對數標度）。使用線性回歸

分析，根據您的CT值確定樣本的DNA濃度

通過PCR獲得。高水平的8.2kb產物代表較少的mtDNA損傷。

Detroit R&D整套DNA損傷分析試劑盒可用于人、大鼠或小鼠的血液、細胞或組織。由于缺失和鏈斷裂造成的DNA損傷可以用此試劑盒檢測，使用微板格式的DNA分離技術，該試劑盒可以很容易地用于高通量格式。在這方面，Detroit R&D研發分析是一個很有前途的工具，因為快速，操作簡單，只需要少量的測試物質。