細胞凋亡檢測試劑盒的原理、使用方法及注意事項

　　細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡是為維持環境穩定，為更好的適應勝春環境而主動爭取的一種死亡過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等作用，是一種字體損傷的現象。zui常用的目前就是細胞凋亡檢測試劑盒。

　　細胞凋亡檢測試劑盒原理

　　細胞凋亡是細胞的基本特征之一，在機體的胚胎發育、組織修復、內環境的穩定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V是一種分子量為35.8 KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉到膜外的磷脂酰(Phosphatidylserine, PS)高親和力特異結合。FITC-Annexin V結合到凋亡細胞后，在藍色光的激發下，發出綠色熒光，區分出凋亡細胞與正常細胞。碘化丙啶(Propidium iodide，PI)是一種核酸染料，它不能穿透完整細胞膜，但對凋亡晚期細胞和死細胞的破損細胞膜能夠穿透，并使細胞核紅染。將FITC-Annexin V與PI匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞區分開來。

　　細胞凋亡檢測試劑盒使用步驟

　　1. 調整待測細胞的濃度為5×105-1×106個/ml。 2. 取1ml細胞，1000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清。 3. 加入1ml預冷的PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清(對于貼壁細胞，先用ymei消化，再用PBS洗滌)。 4. 重復步驟3兩次。 5. 將細胞重懸于200μl Binding Buffer。 6. 加入10μl Annexin V-FITC和10μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應15分鐘 或4℃反應30 分鐘。 7. 加入300μl Binding Buffer，在1小時內用流式細胞儀檢測。 8. 若用熒光顯微鏡檢測，將細胞混合液離心，取細胞沉淀涂片，再進行觀察。

　　使用細胞凋亡檢測試劑盒的注意事項

　　為保證得到理想的實驗結果在使用此試劑盒之前請認真閱讀該注意事項。

　　1.旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

　　2.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物質，在保存與操作時請注意避光。

　　3.Propidium iodide(PI)能通過皮膚吸收，對眼睛有刺激作用。

　　4.在細胞洗滌的zui后一步，請盡量將上清棄凈，以免PBS殘留影響實驗結果。

　　5.PI染色時間過長有可能造成檢測的凋亡率偏高，建議首先進行Annexin V-FITC染色，上機前5分鐘再加入PI染色。

　　6.整個操作過程動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞，盡量在4℃下操作。

　　7.反應完畢后請盡快檢測，因為細胞凋亡是一個動態的過程，反應1小時后熒光強度就開始衰變。

　　8.成功的檢測凋亡受以下幾種因素的影響，如細胞類型、細胞膜上PS的密度、發生凋亡時PS翻轉的比例、誘導細胞凋亡的方法、所用試劑、誘導凋亡的時間等，把這些影響因素進行優化對實驗成功是非常必要的。

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