多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)服務(wù)

我該如何得到好的多色結(jié)果呢？

A1：首先，您需要有質(zhì)量不錯(cuò)的樣本和抗體，這就已經(jīng)是成功的一半（樣本、抗體選擇攻略），對(duì)于樣本來說，脫片是我們需要預(yù)防的“頭號(hào)公敵"，多色實(shí)驗(yàn)需要重復(fù)熱修復(fù)洗脫抗體多次，假如片子脫片，輕則成像模糊，重則組織脫落前功盡棄，可以在開始實(shí)驗(yàn)之前先模擬幾輪熱修復(fù)，不加抗體和其他試劑，看看組織是否有脫落的跡象，如果脫落比較嚴(yán)重，則需要重新制備切片，如果有輕微脫片，則可以考慮購買抗體洗脫液，替代熱修復(fù)的過程；然后，就可以開始做實(shí)驗(yàn)了，我們建議您先進(jìn)行抗體和染料工作條件摸索，再上多染（參考下圖流程），這樣多染的成功率可以達(dá)到90%以。
最后的10%，就需要調(diào)整指標(biāo)與染料搭配以及染色的順序了。

Q2：有沒有推薦的染料搭配和染色順序呢？

A2：染料搭配一般遵循“寡靶配強(qiáng)光，眾靶配弱光"的原則，意思是表達(dá)比較弱的指標(biāo)搭配熒光信號(hào)比較強(qiáng)的染料，表達(dá)相對(duì)強(qiáng)的指標(biāo)搭配信號(hào)比較弱的染料，Absin的TSA染料波長越短熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，比如說需要染PD-1，CD8和CD3，我們手里有一個(gè)四色試劑盒（TSA520/TSA570/TSA650），通過IHC發(fā)現(xiàn)樣本中PD-1的信號(hào)很少，CD3信號(hào)非常多，其次是CD8，于是選擇TSA520搭配PD-1，TSA650搭配CD3，TSA570搭配CD8，比較合理。

接下來就是怎么安排染色先后順序：

1）劃分細(xì)胞定位，先外后內(nèi)：確定每個(gè)指標(biāo)的細(xì)胞定位，膜表達(dá)先染，胞漿或者胞核的后染（如果是指標(biāo)比較多的情況下，胞內(nèi)指標(biāo)排在比較后面，經(jīng)過前期多輪洗脫，可以不做細(xì)胞通透；如果指標(biāo)很少，染胞內(nèi)指標(biāo)之前還是需要打孔，多個(gè)胞內(nèi)指標(biāo)也只需要打一次孔）；
2）確定抗原修復(fù)方式，先酸后堿：堿修復(fù)比酸修復(fù)的力度會(huì)更強(qiáng)，個(gè)別抗體在用堿修復(fù)以后會(huì)染出來很多非特異性，所以如果是相同的細(xì)胞定位，就先染酸修復(fù)，再染堿修復(fù)的抗體；
3）根據(jù)IHC結(jié)果判別，先弱后強(qiáng)：組化結(jié)果顯示指標(biāo)比較少，比較弱的，排在前面染，理論上來說越靠前染的指標(biāo)效果會(huì)越接近單標(biāo)染色。

以上就是一些通用規(guī)則，但不同的指標(biāo)還是可能出現(xiàn)變化，要想得到好的結(jié)果，就需要不同的排列組合一個(gè)一個(gè)嘗試（如下表，“X"代表有信號(hào)），這樣會(huì)比較耗費(fèi)時(shí)間和試劑，您可以根據(jù)通用規(guī)則先行一次多染，然后各通道跟熒光單染做對(duì)比，如果效果差別很大，那就再調(diào)整染色順序，如果單染的結(jié)果跟組化差別比較大（出現(xiàn)高背景，非特異性明顯），就要考慮更換染料搭配。

Q3：我成像完了以后想要做數(shù)據(jù)分析，你們有什么軟件推薦嗎？

A3：目前市面上數(shù)據(jù)分析軟件還是比較多的，像免費(fèi)的您可以下載imageJ、Qupath，缺點(diǎn)就是用法都需要您自行摸索；我們公司安裝的是HALO和StrataQuest兩款軟件，HALO是付費(fèi)的，StrataQuest是我們TG的掃描儀平臺(tái)自帶的，從功能、分析的精準(zhǔn)度和可操作性來說，肯定是大大優(yōu)于開源軟件的，且有軟件專業(yè)的技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)能夠答疑解惑。您可以根據(jù)您的實(shí)際情況選擇合適的分析軟件，如果您實(shí)在無從下手，也可以找Absin，我們可以提供數(shù)據(jù)分析的服務(wù)~

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