抗壞血酸氧化酶（AAO）檢測試劑盒活性微量法說明書
注意：正式測定之前選擇 2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
AAO是定位于植物細胞壁的糖蛋白，屬“藍銅氧化酶”家族。細胞壁內(nèi)的抗壞血酸和AAO 與細胞壁的代謝和生長有著密切的聯(lián)系。AAO氧化AsA所形成的MDHA可通過質(zhì)膜上的細胞色素b 還原，該過程中電子的跨膜運輸能夠促進細胞生長。
測定原理：
AAO可直接氧化AsA，通過測定AsA的氧化量，可計算得AAO活力。
自備實驗用品及儀器：
低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板（UV 板）、可調(diào)式移液器、研缽、冰、蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。 臨用前加入2mL蒸餾水充分溶解。
粗酶液提?。?br />按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。16000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。
抗壞血酸氧化酶（AAO）檢測試劑盒AAO 測定操作：
1. 分光光度計/酶標儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到265 nm。
2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。
3. 依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μ L上清液、170μ L預(yù)熱的試劑二和10μ L試劑三， 迅速混勻后在265nm測定10s和130s光吸收A1和A2，△A =A1-A2。
AAO 活性計算公式：
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下(1). 按蛋白濃度計算
AAO 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA為1個酶活單位。AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε ×d）×V 反總×109 ÷(Cpr×V 樣)÷T
= 92.4×△A÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
AAO 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。AAO(nmol/min/g) = △A÷(ε ×d）×V反總×109 ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 92.4×△A÷W
ε ：AsA 在265nm 處摩爾吸光系數(shù)為 5.42×104 L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm； V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μ L=2×10-4 L；106 ：1mol=1×106 μ mol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；W ：樣品

質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μ L=0.02 mL；V 樣總：提取液體積，1 mL； T：催化反應(yīng)時間（min），2min。
抗壞血酸氧化酶（AAO）檢測試劑盒b. 使用96孔板測定的計算公式如下(1). 按蛋白濃度計算
AAO 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。AAO(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε ×d）×V反總×109 ÷(Cpr×V樣)÷T
=184.8×△A÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
AAO 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。AAO(nmol/min/g) = △A÷(ε ×d）×V反總×109 ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 184.8×△A÷W
ε ：AsA 在 265nm 處摩爾吸光系數(shù)為 5.42×104 L/mol/cm；d：96孔板光徑（cm），0.5 cm； V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μ L=2×10-4 L；106：1mol=1×106μ mol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μ L=0.02 mL；V 樣總：提取液體積，1 mL； T：催化反應(yīng)時間（min），2min。
抗壞血酸氧化酶（AAO）檢測試劑盒注意事項:
配制好的試劑放在 4℃保存，三天內(nèi)使用完