單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）檢測(cè)試劑盒活性微量法說(shuō)明書
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
MDHAR催化MDHA還原生成AsA，在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。
測(cè)定原理：
MDHAR催化NADH還原MDHA生成AsA和NAD +，NADH在340nm有特征吸收峰，但是NAD+沒有。通過(guò)測(cè)定340nm光吸收下降速率，來(lái)計(jì)算出MDHAR活性。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和雙蒸水
試劑組成和配置：
試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。試劑二：液體×1 瓶，室溫保存。
試劑三：粉劑×1 瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入3mL蒸餾水充分溶解。試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入2.5mL蒸餾水充分溶解。
試劑五：液體×1 瓶，4℃保存。臨用前加3mL試劑二充分溶解。
粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織， 加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500 萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔 7秒，總時(shí)間3min）； 8000g ，4℃離心20min，取上清液置冰上混勻待測(cè)。
3. 血清等液體：直接測(cè)定。
單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）檢測(cè)試劑盒MDHAR 測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱30min。
3. 依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μ L試劑三、20μ L試劑四、20μ L試劑五和120μ L 試劑二，最后加入20μ L上清液，迅速混勻后于340nm比色，記錄30s和150s的吸光值30s和150s 的吸光值A(chǔ)1和A2，△A=A1-A2。
MDHAR 活性計(jì)算公式：
a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下(1). 按蛋白濃度計(jì)算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH為1個(gè)酶活單位。MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε ÷d×V 反總×109]÷（Cpr×V 樣）÷T
= 804×△A ÷Cpr
樣本質(zhì)量計(jì)算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol NADH為1U。
MDHAR (nmol/min/g) = △A÷ε ÷d×V 反總×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T
= 804×△A ÷W
(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH為1個(gè)酶活單位。MDHAR (nmol/min/104cell) = △A÷ε ÷d×V 反總×109÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T
= 804×△A ÷ 細(xì)胞數(shù)量
(4). 按液體體積計(jì)算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε ÷d×V 反總×10 9 ÷V 樣）÷T
= 804×△A
ε ：NADH 摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積， 0.2mL=2×10 -4 L；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μ L=0.02mL；V 樣總：提取液體積，
1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量 BCA 試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。
單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）檢測(cè)試劑盒b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε ÷d×V 反總×10 9 ]÷（Cpr×V 樣）÷T
= 1608×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1U。
MDHAR (nmol/min /g) = △A÷ε ÷d×V 反總×10 9 ]÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T
= 1608×△A ÷W
（3） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
MDHAR 活性單位定義：25℃中每 10 4 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。MDHAR (nmol/min/10 4 cell) = △A÷ε ÷d×V 反總×10 9 ÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）
÷T
= 1608×△A ÷ 細(xì)胞數(shù)量
（4） 按液體體積計(jì)算
單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）檢測(cè)試劑盒MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫升液體每分