進(jìn)口ELISA試劑盒處理方法：

1、  血清

血清是zui常用于ELISA檢測的一類樣本，處理也比較簡單。

用無熱原、無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液標(biāo)本，將試管或離心管室溫放置2小時或4℃一個晚上，使血清析出。（將試管或離心管傾斜放置，使液面橫截面增大，能使血清更大程度的析出。）4℃ 1000×g離心20分鐘，仔細(xì)收集上清。建議將血清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

采血過程中應(yīng)避免溶血，因為紅細(xì)胞裂解時會釋放具有過氧化酶活性的物質(zhì)，在以HRP為標(biāo)記的ELISA檢測中會有非特異性的顯色，而導(dǎo)致檢測的不準(zhǔn)確性。同時也應(yīng)避免細(xì)菌污染，因為菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性的HRP從而導(dǎo)致檢測的假陽性。

2、  血漿

用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標(biāo)本，標(biāo)本采集后30min內(nèi)4℃ 1000×g離心15min，取上清即血漿。將上清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。避免使用溶血或高血脂的標(biāo)本。

常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等，檢測時還應(yīng)仔細(xì)閱讀試劑盒說明書，檢查試劑盒是否對抗凝劑有特殊要求。

3、  細(xì)胞培養(yǎng)上清

取細(xì)胞培養(yǎng)上清到離心管，1000×g離心20min，除去細(xì)胞碎片及雜質(zhì)，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

4、  細(xì)胞裂解液

1、吸去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，用胰酶消化細(xì)胞，加適量培養(yǎng)基將細(xì)胞從培養(yǎng)板上吹下來。懸浮細(xì)胞可省略。

2、收集細(xì)胞懸液，1000×g離心10min，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS潤洗3次。

3、加入適量的預(yù)冷PBS或細(xì)胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞。通常6孔板一個孔的細(xì)胞量需要150~250μL PBS重懸。

4、將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復(fù)凍融幾次，使細(xì)胞充分裂解。也可將樣品進(jìn)行超聲破碎，以達(dá)到裂解的目的。

5、4℃ 10000×g 離心10min，除去細(xì)胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

5、組織勻漿液

1、將組織樣本用PBS (0.01 [錨點(diǎn)] [錨點(diǎn)] M, PH 7.4) 沖洗，洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì)。

2、將組織塊稱重，記錄后剪碎，碎塊應(yīng)盡量小，便于勻漿得更充分

3、將組織按一定的比例加入預(yù)冷的PBS（臨用前加入蛋白酶抑制劑）勻漿，勻漿時置于冰上或冰浴中。（通常按組織重量：PBS體積=1:9的比例勻漿，例如1g的組織樣本對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗需要適當(dāng)調(diào)整，檢測后計算樣品濃度時應(yīng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)）

4、 吸取勻漿液到離心管，4℃ 5000×g 離心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

6、  尿液、唾液等其他液體生物樣本

1000×g離心20min，取上清即可檢測。

總的來說，因為ELISA只能檢測可溶性蛋白的含量，所以應(yīng)保證所有樣本均為澄清的液體，沉淀或懸浮物都應(yīng)離心去除。

進(jìn)口ELISA試劑盒操作步驟：

1.使用前將試劑盒置室溫30分鐘，恢復(fù)至室溫。

2.取所需用量酶標(biāo)板條，設(shè)空白對照1孔、陰性/陽性對照各2孔，未用的板條盡快密封，2～8℃保存。

3.空白對照孔加樣品稀釋液100μl；陰、陽性對照孔分別加入陰、陽性對照100μl；樣品孔每孔加入稀釋后的樣品100μl。

4.混勻，置37℃反應(yīng)30分鐘。

5.扣去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，拍干。

6.每孔加酶標(biāo)記物100μl（空白孔除外）。置37℃反應(yīng)30分鐘。

7.洗滌，同步驟5。

8.每孔依次加底物液A、底物液B各50μl，混勻，37℃避光反應(yīng)10分鐘。

9.每孔加終止液50μl，混勻，用空白孔調(diào)零，于450nm(可用630nm作參比波長）測定各孔吸光值（A值）。