試劑空白吸光度是反映試劑質量的指標,但不能反映試劑質量的全部。試劑成份、純度、用量及穩定性,才是保證試劑質量的關鍵所在。目前市售的一些試劑具有抗干擾作用,主要是通過加入抗干擾物質或使用新的色素原以避免內源性物質的干擾。但值得注意的是:一些試驗項目在消除內源性物質干擾的同時,會帶來樣品含量真實性的變化。
每種試劑都有一定的空白吸光度范圍,試劑空白吸光度的改變往往提示該試劑的變質;如利用Trinder反應為原理的檢測試劑會因含酚類物質被氧化為醌而變為紅色。堿性磷酸酶、r一谷氨酰轉肽酶、淀粉酶等檢測試劑會因基質分解出硝基酚或酚基苯胺而變黃。有些試劑久置后變渾濁。這些情況均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶等負反應,在放置過程中其試劑空白吸光度會因NADH自行氧化為NAD+而下降。原則上,吸光度上升的反應,其試劑空白吸光度越低越好,不能超過一個高限;相反,吸光度下降的反應,其試劑空白吸光度不能低于一個低限。因此,試劑空白吸光度限值,常作為程序參數輸入儀器,如經核查超限,儀器會自動報警,提示更換試劑。需要指出的是,還原型輔酶I(或II)等投料量不足或劣質的原料,往往需要加大用量,才使“表觀”吸光度上升,湊合過試劑空白核對的“關”,其后果為如下情況:
1)、線性范圍變窄 現象:高值測不高。原因:試劑時有效成分投料量不足;試劑成份穩定性較差。
2)、靈敏度變低現象:酶促反應速度曲線斜率下降,測定結果有嚴重系統誤差。原因:試劑底物濃度不足。
3)、低值偏高 現象:試劑空白的變化曲線(吸光度VS時間)明顯波動。原因:試劑自身不穩定,自行分解;工具酶純度不夠,雜酶含量超限,導致干擾作用。
丙烯葡聚糖凝膠S-200 HR,Sephacryl S-200 High resolution每種試劑都有一定的空白吸光度范圍,試劑空白吸光度的改變往往提示該試劑的變質;如利用Trinder反應為原理的檢測試劑會因含酚類物質被氧化為醌而變為紅色。堿性磷酸酶、r一谷氨酰轉肽酶、淀粉酶等檢測試劑會因基質分解出硝基酚或酚基苯胺而變黃。有些試劑久置后變渾濁。撫生生物這些情況均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶等負反應,在放置過程中其試劑空白吸光度會因NADH自行氧化為NAD+而下降。
反應中抗Vc干擾問題:由于維生素c易氧化,樣品中Vc會競爭反應生成的過氧化氫,而產生負干擾。上海撫生生物因此,在試劑R1中加入抗壞血酸氧化酶,這種方法是有效的,但不一定有很大的意義。因為Vc干擾必須同時具備二個條件:丙烯葡聚糖凝膠S-200 HR,Sephacryl S-200 High resolutiona)Vc攝入量較多;b)采血后立即測定。實驗表明離體血清中Vc在90 min后會全部被氧化。又如,使用胺類新色原。分子共軛結構特性使得靈敏度提高,相應可以減少樣本用量,較終能有效地降低干擾物的量.b)使生成胺類色素原較大吸收峰由500~520 nm移至550 nm以上,以避開黃疸、溶血干擾。如:亞鐵一H 0 ,能有效避免黃疸干擾的理論依據是亞鐵與H。0。親和力遠遠大于膽紅素。甘油三酯測定,有人主張選用雙試劑方法消除內源性甘油,這個方法是可行的,但忽視了一個化學平衡理論。因為所有的酯在水溶液中都不是簡單地以酯的形式存在,而是以水解與酯化相平衡的形式存在。撫生生物 在一個平衡體系中,如果去除游離甘油,這個平衡就向生成甘油方向移動,甘油三酯就會重新水解,生成新的甘油,達到新的平衡,因此樣品與R1試劑孵育時間越長,測得甘油三酯值就越低。
甘油三酯測定,不僅要去除游離甘油,而且還要克服樣本含量真實性發生的變化,試劑中必須加入甘油激酶,并且延遲時間要標準化。所以,一些試驗項目在消除內源性物質干擾的同時,會帶來樣品含量真實性的變化。