石蠟包埋組織切片免疫染色實驗步驟（建議方案）：

石蠟包埋組織切片 3~4μm 厚度

1.烤片： 將待做切片置于切片架上，于 60℃恒溫烤箱中至少烤 1 hr；

2.脫蠟： 切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟 3 次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次

10 min；

3.水化： 切片經(jīng)下行酒精水化，無水乙醇 5min，95%乙醇 2 次（每次 2min），85%

乙醇 2 min；75%乙醇 2min，自來水沖洗，ddH2O 洗 2×2min；

4.抗原修復(fù)： 根據(jù)抗體說明書推薦方法進行抗原修復(fù)，常采用高壓、微波（溫

度達到 98~100℃）或酶消化修復(fù)法，室溫自然冷卻，自來水沖洗，ddH2O 洗 2×

2min，TBS 洗滌（2×2min）（具體修復(fù)方法見附 1）* 注：有些抗原勿需修復(fù)，

直接進入第 5 步封閉。

5.封閉： 滴加試劑 B，37℃濕盒孵育 30 min；

6.加一抗：滴加用試劑 C（即用型一抗），37℃濕盒孵育 2 hr 或 4℃過夜；

7.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）；

8.封閉： 滴加試劑 B，37℃濕盒孵育 10 min；

9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物su 化二抗（試劑 D），37℃濕盒中孵育

30 min；

10.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）；

11.封閉： 滴加試劑 Tween 20，37℃濕盒孵育封閉 20 min；

12.加 HRP-SA： 滴加用試劑 C 稀釋的試劑 E（1：50~200，終濃度 5~20 nM），37

℃濕盒中孵育 30 min；

13.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min），TBS 洗滌（2×5 min）；

14.顯色：應(yīng)用 DAB 溶液（試劑 F）顯色；

15.復(fù)染：自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明；

16.封片： 待組織標本干后，用試劑緩沖甘油封固劑封片；

17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。