遺傳病的基因診斷選擇一、直接診斷和間接診斷
　　
　　基因診斷可分為兩類：一類是直接檢查致病基因本身的異常。它通常使用基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針，或通過PCR擴增產物，以探查基因無突變、缺失等異常及其性質，這稱為直接基因診斷，它適用已知基因異常的疾病；另一類是基因間接診斷。當致病基因雖然已知但其異常尚屬未知時，或致病基因本身尚屬未知時，也可以通過對受檢者及其家系進行連鎖分析，以推斷前者是否獲得了帶有致病基因的染色體。連鎖分析是基于緊密連鎖的基因或遺傳標記通常一起傳給子代，因而考察相鄰DNA是否傳遞給了子代，可以間接地判斷致病基因是否傳遞給子代。連鎖分析多使用基因組中廣泛存在的各種DNA多態性位，特別是基因突變部位或緊鄰的多態性位點作為標記。RFLP、VNTR、SSCP、AMP－FLP等技術均可用于連鎖分析。
　　
　　二、基因異常與診斷方法的選用
　　
　　各種遺傳病的基因異常是不同的，同一遺傳病也可以有不同的基因異常，但這些異常大體可分為基因缺失和突變兩大類型。后者包括單個堿基置換、微小缺失或插入。近年來不發現一些遺傳病是由于基因內的三核苷酸重復順序增加引起的，根據對基因異常類型的了解，可以采用不同的診斷方法（表13－2）。如基因缺失可用基因探針雜交，PCR擴增直接檢測；點突變可用等位基因特異的ASO探針、SSCP等直接檢查。一般無需對家系成員進行分析。但條件是必需知道基因異常的性質，并肯定該異常與疾病之間的關系。然而，由于許多疾病的遺傳異質性，以及多數遺傳的基因異常尚屬未知，目前能直接診斷的病種雖日益增多，但仍然是比較有限的。
　　
　　表13－2遺傳的基因診斷方法
　　
　　基因異常方法探針、引物或限制酶基因缺失基因組DNA印跡雜交
　　
　　PCR擴增缺失基因的探針
　　
　　引物包括缺失或在缺失部位內點突變RFLP分析
　　
　　ASO雜交
　　
　　PCR產物的多態性分析
　　
　　（RFLP、SSCP、DGGE）突變導致其切點消失的限制酶
　　
　　正常和異常的ASO探針
　　
　　引物包括突變部位基因已知但異常不明基因內或旁側序列多態性（RFLP、AMP－FLP，SSCP）連鎖分析基因內或旁側序列探針或引物基因未知與疾病連鎖的多態性，如SSCP、AMP－FLP連鎖分析，RFLP位點單體型連鎖分析與疾病連鎖的多態位點探針或引物
　　
　　許多遺傳病的基因尚未分離克隆，或基因異常尚不清楚，因此還不能根據突變的性質進行診斷。但如果通過家系分析能證明某一DNA標記（無論是等位基因還是多態性位點或片段）與致病基因連鎖，則凡帶有該標記的成員都可能帶有致病基因，從而可作出間接的連鎖分析診斷。
　　
　　應用連鎖分析診斷時應注意如下幾個問題：①基因與DNA標記之間可能發生重組。因此連鎖分析的準確性取決于DNA與致病基因連鎖的緊密程度，連鎖愈緊密，可靠性愈高，故應采用盡量靠近致病基因，即連鎖緊密的標記，或采用多個遺傳標記以盡可能排除重組。由于可能存在重組，連鎖分析不能*確定致病基因是否存在，而是指出存在可能性或概率的大小。如果標記距基因有5cM，即重組率為5％，則作出診斷時尚有5％誤差的可能，即只有95％的把握作出肯定或否定的結論。②選用的遺傳標記在人群中的雜合度。如果標記的雜合度在人群中很低，即多數個體為純合子，則這種標記用處不大。因為如家系中關鍵成員不能提供致病基因在哪一條染色體上的信息，常使連鎖分析無法進行，因此需選用人群中雜合度高的標記。③在連鎖分析時，有時只分析一個多態位點還不能把某一家系中帶有致病基因的染色體與正常染色體區分開來。這通常是由于關鍵成員如待診者的父母是純合子，不能提供必要的信息，這時可同時分析更多的多態位點，即作單倍型（haplotype）分析。單倍型是指一條染色體上兩個或兩個以上多態位點的狀態的組合。兩條染色體多個位點上都純合的概率畢竟是很小的，因此單倍型有助于區分兩條常染色體，并追蹤致病基因的分離情況。
　　
　　三、遺傳病的基因診斷舉例
　　
　　1．基因缺失型遺傳的診斷
　　
　　（1）α地貧的基因診斷：α地貧主要是由于基因缺失引起的，缺失的基因可以由1－4個。正常基因組用BamHⅠ切割，可以得到一個14kb的片段，而缺失一個α基因時切點向5’端移位，得到一條10kb的片段。因此，當用α基因探針與基因組DNA進行Southern雜交時（圖13－8），在α地貧2可見一條14kb和一條10kb的帶，在正常人可見一條雙份的14kb的帶，而在α地貧1則見一條單拷貝的14kb帶，血紅蛋白H病時只有一條10kb的帶的，而在Barts水腫胎時，則無任何雜交帶。
　　
　　圖13－8α地貧基因缺失的診斷
　　
　　左圖：16號染色體上攜有數目不同的基因
　　
　　右圖：α基因探針雜交的結果
　　
　　箭頭：BamHⅠ切點
　　
　　一種較簡便的方法是直接用α探針進行斑點雜交，自顯影后根據斑點深淺的不同也可以對α地貧作出診斷。更為簡單的方法是PCR診斷，即在α基因缺失范圍內設計一對引物，然后PCR擴增胎兒的DNA，如為Barts水腫胎，則無擴增產物，電泳后無任何帶紋，從而可建議進行人工流產，但此法不能診斷其它類型的地貧（除非另設計引物用作PCR）。
　　
　　（2）DMD／BMD的缺失型診斷：DMD／BMD是一種Ⅹ連鎖隱性遺傳的神經肌肉系統受累的致死性遺傳病（參閱第四章）。DMD／BMD有70％左右為缺失型。此基因很大，缺失可發生在不同部位，因此應盡可能采用多對引物作PCR擴增（多重PCR）來檢測。如擴增產物電泳后發現有帶紋的缺失，即可作出診斷并對缺失定位（圖13－9），在進行產前診斷時，一般可先通過檢測家系中有關成員，即確定先證者的缺失區，然后有針對性地作PCR擴增，包括缺失部分的兩端，以判斷胎兒或有關患兒是否也獲得了相同的基因缺失，但非缺失型不能用此法查出。
　　
　　遺傳病的基因診斷選擇2．點突變型遺傳病的基因診斷2
　　
　　（1）鐮形細胞性貧血的基因診斷：已知突變基因是編碼β珠蛋白鏈的第6位密碼子由GAG變為GTG，從而使纈氨酸取代了甘氨酸，因此可用如下方法進行診斷。
　　
　　圖13－9DMD基因缺失的多重PCR診斷
　　
　　exon：外顯子；pm:啟動子；1：正常9條帶；2：基因全缺失；3：啟動子區缺失；4：第3外顯了缺失；5：第13外顯子缺失；6：第47外顯子缺失；7：47－52外顯子區段缺失；8：第52外顯子缺失
　　
　　1）RFLP診斷：已知限制酶MstⅡ切割的識別順序是CCTNAGG，它能切割正常β鏈中CCTGAGG序列，但不能切割突變了的CCTGTGG（A→T）。這樣，由于突變消除了一個切點，使內切酶長度片段發生了改變，通過電泳，就可以區別正常的βA和βS（圖13－10）。
　　
　　圖13－10鐮狀貧血的基因診斷
　　
　　除MstⅡ外，限制酶DdeⅠ（識別序列為CTNAG）也能夠把正常的βA基因與鐮變了的βS基因區別開來，并用于診斷。
　　
　　2）ASO探針診斷：由于突變部位和性質已*明了，也可以合成寡核苷酸探針，用32P標化來進行診斷。此時需要合成兩種探針，一種與正常βA基因序列*一致，能與之穩定地雜交；另一種與突變基因序列一致，能與βS基因穩定雜交，但不能與正常的βA基因雜交。根據雜交結果，就可以把發生了突變的βS基因檢測出來。
　　
　　PCR技術問世以來，ASO診斷又有新的改進，即先PCR擴增長約110bp的基因片段，然后再與ASO探針雜交。這樣可減少目的基因DNA用量，并降低與基因組DNA雜交時的非特異性信號。