士鋒生物免疫瓊脂雙向擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)原理、方法與結(jié)果觀察

2014年01月17日 07:40上海士鋒生物科技有限公司點(diǎn)擊量：1137

可溶性抗原與相應(yīng)抗體持異性結(jié)合，兩者比例適當(dāng)并有電解質(zhì)存在及一定的溫度條件下，經(jīng)一定的時(shí)間，可形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng) (precipitation ) 。沉淀反應(yīng)的抗原可以是多糖、蛋白質(zhì)、類脂等。與相應(yīng)的抗體相比，抗原分子小 ( < 20pm) ，單位體積中所含抗原量多，具有較大的反應(yīng)面積。為了使抗原抗體之間比例適合，不使抗原過(guò)剩，故一般均應(yīng)稀釋抗原，并以抗原zui高稀釋度仍能與抗體出現(xiàn)沉淀反應(yīng)為該抗體的沉淀反應(yīng)效價(jià) ( 滴度 ) 。

瓊脂擴(kuò)散( agar diffusion )為可溶性抗原與抗體在瓊脂凝膠中所呈現(xiàn)的一種沉淀反應(yīng)。當(dāng)對(duì)應(yīng)的抗原、抗體在半固體瓊脂終相遇，且二者比例適當(dāng)時(shí)，便出現(xiàn)可見的白色沉淀線，這組沉淀線是一組抗原、抗體的特異性復(fù)合物。當(dāng)瓊脂中有多組不同的抗原、抗體存在時(shí)，便各自依其擴(kuò)散速度的差異，再適當(dāng)?shù)牟课恍纬瑟?dú)立的沉淀線。因此，瓊脂擴(kuò)散不僅用于疾病的診斷，更廣泛地用于抗原成分的分析。

免疫瓊脂雙向擴(kuò)散是將可溶性抗原和抗體分別加到瓊脂板上相應(yīng)的小孔中，兩者各自向四周擴(kuò)散，如抗原與抗體相對(duì)應(yīng)，兩者相遇即發(fā)生待異性結(jié)合，并在比例適合處形成白色沉淀線 ( 圖 5-1) 。如果所加抗原和抗體標(biāo)本中分別含有若干與血清學(xué)反應(yīng)無(wú)關(guān)的抗原抗體，則因各種抗原的擴(kuò)散系數(shù)和各對(duì)抗原抗體間的zui適比例不同，以及抗原抗體復(fù)合物所形成的沉淀線具有選擇性滲透屏障作用，擴(kuò)散后可以形成若干條沉淀線， — 條沉淀線代表一對(duì)抗原抗體。因此，通過(guò)雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，用已知抗體 ( 或抗原 ) 檢測(cè)未知抗原 ( 或抗體 ) ，可鑒定抗原性物質(zhì)或免疫血清的濃度、純度及比較抗原之間的異同點(diǎn)。

免疫瓊脂雙向擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)原理、方法與結(jié)果觀察

圖 5-2 免疫瓊脂雙向擴(kuò)散打孔圖

【結(jié)果觀察】

觀察孔間沉淀線的數(shù)目及特征。本試驗(yàn) 1 至 5 孔( 1 ： 2 、 1 ： 4 、 1 ： 8 、 1 ： 16 和 1 ： 32 的人抗兔 IgG )與中央孔 ( 人血清 ) 之間可出現(xiàn)清晰的乳白色沉淀線(圖 6-3 )沉淀線。沉淀線與中央孔的距離隨抗原的濃度減小而增大。

圖 6-3 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果示意圖。

【注意事項(xiàng)】

1. 加樣時(shí)不要將瓊脂劃破，以免影響沉淀線的形成。

2. 反應(yīng)時(shí)間要適宜，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，沉淀線可解離而導(dǎo)致假陰性、不出現(xiàn)或不清楚。

3 .加樣時(shí)不同濃度抗體和抗原不要混淆，影響試驗(yàn)結(jié)果。

4 .試驗(yàn)前應(yīng)做預(yù)試驗(yàn)，確定抗體的稀釋度。

【作業(yè)】

1. 記錄免疫瓊脂雙向擴(kuò)散的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2. 說(shuō)明凝集反應(yīng)與沉淀反應(yīng)的區(qū)別。

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