金櫻子染料法PCR鑒定試劑盒引物設計基本原則:
1、引物長度：18-26bp，可放寬至18-30bp（有研究表明超過30bp再增加引物長度意義不大）；
2、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
3、引物Tm：54-58℃，可放寬至52～62℃，GC%>60%可進一步放寬；
4、擴增子Tm：>92℃；
5、3'端：優選三聯體WSS、SWS、TTS，二連體GC，單體S，盡量規避WWW、CGW、GGG、CG；
6、引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個堿基在待擴增區以外不能有全互補序列，否則易導致非特異性擴增；
7）、末端2bp最好為GC；
8）、引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用熒光物質標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等；
9）、其他：避免3'端8bp及以上序列與模板多位點互補，盡量避免上下游3'端4bp及以上反向互補，盡量避免內部回文。

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金櫻子染料法PCR鑒定試劑盒引物設計基本原則

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