人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞來源的exosome下調(diào)LOXL2緩解小鼠肝纖維化的作用機(jī)制研究

目的肝纖維化是肝硬化的必經(jīng)中間環(huán)節(jié),其主要病理過程是肝星狀細(xì)胞(hepatic slate cell,HSC)活化為肌成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過量沉積及肝組織結(jié)構(gòu)破壞。前期研究已表明人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,huc MSC)來源的exosome(huc MSC derived-exosome,huc MSC-Ex)可緩解小鼠肝纖維化,但其具體機(jī)制仍不清楚。本研究在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討huc MSC-Ex抗纖維化的作用機(jī)制。方法分離培養(yǎng)huc MSC,蔗糖/重水超速離心法提取huc MSC-Ex,透射電鏡觀察huc MSC-Ex形態(tài),Nano Sight納米顆粒跟蹤分析儀檢測huc MSC-Ex直徑分布,Western blot檢測huc MSC-Ex表面標(biāo)志物CD9、CD63。體內(nèi)注射四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)建立BALB/c小鼠肝纖維化模型,并應(yīng)用huc MSC-Ex進(jìn)行治療,分組如下:PBS組(n=10),huc MSC-Ex組(n=10);動物活體成像檢測huc MSC-Ex在小鼠體內(nèi)分布,通過肝臟大體觀、H&E染色、Masson染色等技術(shù)觀察肝纖維化組織結(jié)構(gòu)及膠原沉積,免疫組化和Western blot檢測賴氨酰氧化酶樣蛋白2(lysyl oxidase-like 2,LOXL2)、HSC活化指標(biāo)成纖維細(xì)胞活化蛋白(Fibroblast Activation Protein,FAP)及α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)的表達(dá)。體外誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞(LX-2)細(xì)胞活化,與huc MSC-Ex共培養(yǎng),RT-PCR、Western blot和免疫熒光檢測LOXL2、一型膠原(collagenⅠ,COL1)及FAP表達(dá)。免疫組化及Western blot檢測肝組織及LX-2細(xì)胞中Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)表達(dá);利用重組腺病毒或質(zhì)粒過表達(dá)或敲除YAP,Western blot檢測LOXL2蛋白表達(dá);熒光素酶報告基因檢測YAP對LOXL2的轉(zhuǎn)錄活性,分析YAP對LOXL2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Western blot檢測huc MSC-Ex中14-3-3ζ表達(dá);利用重組腺病毒轉(zhuǎn)染huc MSC過表達(dá)14-3-3ζ,收集提取并鑒定14-3-3ζ過表達(dá)exosome(Ad-14-3-3ζ-Ex);Ad-14-3-3ζ-Ex及對照組exosome(Ad-GFP-Ex)與活化的LX-2細(xì)胞共培養(yǎng),Western blot、免疫熒光檢測LX-2細(xì)胞14-3-3ζ、YAP表達(dá),分析14-3-3ζ與YAP核定位的相關(guān)性。結(jié)果Huc MSC-Ex呈球形膜性囊狀結(jié)構(gòu),直徑30~100nm左右,表達(dá)CD9、CD63等exosome表面標(biāo)志物。動物活體成像顯示熒光染料標(biāo)記的huc MSC-Ex主要集中于肝纖維化小鼠肝臟組織,并且在huc MSC-Ex處理的肝臟中檢測到exosome標(biāo)志物CD63表達(dá)。與PBS組相比,huc MSC-Ex組小鼠肝纖維化減輕,肝組織中壞死結(jié)構(gòu)減少,膠原沉積減弱,同時LOXL2表達(dá)下調(diào)、HSC活化指標(biāo)FAP及α-SMA表達(dá)降低;huc MSC-Ex與誘導(dǎo)活化的LX-2細(xì)胞共培養(yǎng)后,LOXL2、COL1及FAP表達(dá)下降。在肝纖維化小鼠肝臟及活化的LX-2細(xì)胞中YAP核定位及LOXL2表達(dá)相關(guān);在293T、LX-2、HL7702細(xì)胞中過表達(dá)YAP導(dǎo)致LOXL2蛋白表達(dá)增加,敲減YAP后,LOXL2蛋白表達(dá)下降;熒光素酶報告基因檢測表明YAP對LOXL2具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。在活化的LX-2細(xì)胞中,Ad-14-3-3ζ-Ex具有比Ad-GFP-Ex更強(qiáng)的LOXL2表達(dá)抑制及YAP核定位抑制作用。結(jié)論HucMSC-Ex通過下調(diào)LOXL2表達(dá)抑制HSC的活化,緩解肝纖維化,其機(jī)制可能通過轉(zhuǎn)運(yùn)14-3-3ζ抑制YAP核定位相關(guān)。